Övervakning av immunceller Trafficking Lysrör Prion Spön timmar efter intraperitoneal Infektion
Summary
Här beskriver vi ett nytt test för övervakning av prioner upptag och handel av immunceller omedelbart efter intraperitoneal ympning av renande och fluorescerande märkning aggregerade prion spön från infekterade material från hjärnan sedan övervaka deras upptag och rörelse från injektionsstället och karaktärisera celler förmedla dessa händelser.
Abstract
Förekomst av en abnorm form en värd-kodad prionproteinet (PrPC) som är proteas resistenta, patologiska och smittsamma kännetecknar prionsjukdomar såsom Chronic Wasting Disease (CWD) av hjortdjur och scrapie hos får. Den Prion hypotesen hävdar att denna onormala fogar utgör de flesta eller alla av de smittsamma prioner. Roll i immunsystemet i början av händelser i perifera prion patogenes har övertygande visats för CWD och scrapie 1-3. Transgena och farmakologiska studier i möss visade en viktig roll i komplementsystemet i att behålla och replikera prioner tidigt efter infektionen 4-6. In vitro och in vivo-studier har också observerats prion behåller dendritiska celler 7-10, även om deras roll i handeln är fortfarande oklart 11-16. Makrofager har likaledes varit inblandade i början av prion patogenes, men dessa studier har fokuserat på händelser som inträffar veckor efter smittotillfället 3,11,17. Dessa tidigare studier lider också av problemet att skilja mellan endogena PrP C och smittsamma prioner. Här beskriver vi en semikvantitativ, objektiva tillvägagångssätt för att bedöma prioner upptag och människohandel från inokulationsstället av immunceller rekryteras dit. Aggregerad prion stavar var renat från infekterade hjärnan homogenatet av rengöringsmedel lösningsgörande av icke-aggregerade proteiner och ultracentrifugering genom ett sackaros kudde. Polyakrylamidgelelektrofores, coomassie blå färgning och Western blotting bekräftade återvinning av höganrikat prion spön i pelleterat fraktion. Prion stavar var fluorokrom-märkt sedan injiceras intraperitonealt på möss. Två timmar senare immunceller från peritoneal lavage, mjälten och mediastinum och kröslymfknutor analyserades för prioner spö lagring och delmängder cell identifieras med multicolor flödescytometri med hjälp av markörer för monocyter, neutrofiler, dendritiska celler, makrofager och B-och T-celler. Denna analys gör det möjligt för första gången direkt övervakning av immunceller förvärva och prioner människohandel in vivo inom några timmar efter infektion. Denna analys också tydligt skiljer smittsamma, aggregerade prioner från PrPC uttrycks normalt på värdceller, vilket kan vara svårt och leda till tolkning av data problem i andra test system. Detta protokoll kan anpassas till andra inokulering rutter (oral, intravenös intranervous och subkutan, t.ex.) och antigener (konjugerad pärlor, bakterier, virus och parasiter patogener och proteiner, ägg) också.
Protocol
Discussion
Här visar vi ett protokoll för märkning och spårning av prioner in vivo som avsevärt underlättar övervakning tidigt händelser i perifera prion infektion. Detta protokoll förbättrar i hög grad på tidigare försök till att övervaka prion upptag in vitro 9 och in vivo 3,12 genom att pre-märkning höganrikat prioner inokulat att entydigt skilja den från endogen PrP C. Eftersom smittsamma prioner och PrP C delar samma primära aminosyrasek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Steve McBryant och Jeff Hansen för hjälp med ultracentrifugering och Patti Kiser för hjälp med mus hantering. Det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke vid National Institutes of Health, bevilja 5R01NS056379-02 finansierade detta arbete.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | ||
| Blender | Oster | 6694-015 | Use any commercial blender | |
| Centrifuge | Sorvall | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
| Ultracentrifuge | Beckman | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes | |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | ||
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche | 11 836 170 001 | ||
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power | |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Scientific | 53050 | ||
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g | |
| centrifugal filter columns | Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff | |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River | 207 | Use any inbred mouse strain | |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | ||
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | ||
| fluorescent antibodies | BD pharmingen | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. | |
| flow cytometer | Dakocytomation | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer’s patches’ dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
