重组逆转录病毒的生产和B细胞的感染
Summary
一个有效率的制度中的一个基因的结构和功能分析<em>体外</em>脾B淋巴细胞的文化描述。这种方法需要利用一个辅助的自由，ecotrophic包装细胞系的重组逆转录病毒的生产。稳定，遗传兴趣在初级淋巴细胞基因的表达，是实现领导在接受类开关重组的B细胞表面抗体的生成。
Abstract
在真核细胞基因的转基因表达是一个功能强大的反向遗传学方法，在其中一个感兴趣的基因是异源表达系统的控制下表达，以方便所产生的表型分析。这种方法可以用来在生物体中发现一个不正常的基因表达，表达了一个基因产物的突变形式，或过度表达的基因产物的显性负形式。它是造血系统的研究，转录调控是一个主要控制机制，在发展和分化的B 细胞在2-4审查，特别有用。
小鼠遗传学是研究人类基因和疾病的有力工具。一个小鼠和人类基因组的比较分析，揭示了共线性的保护，在超过90％的基因组5此外，在小鼠模型所使用的技术是适用于人类基因的研究，例如， 基因 干扰和等位基因更换6。然而，转基因小鼠的建立需要一个很大的金融和技术性质资源。有几个项目已经开始编译库（KOMP，EUCOMM，NorCOMM）敲除小鼠品系或突变引起的菌株（理研），这需要大规模的努力和合作 7的。因此，这是可取的，首先研究的一个发展的小鼠模型前，在原代细胞的细胞培养模型所需的基因表型。
逆转录病毒的DNA整合到宿主DNA中，最好内或附近转录单位或CpG岛，稳定和遗传利益打包基因的表达，同时避免转录沉默 8 9。然后下一个高效率的逆转录病毒启动子控制转录的基因，在转录和蛋白质的生产效率高。因此，逆转录病毒表达可用于难转染的细胞，细胞在有丝分裂过程中的一个活跃的状态。由于该病毒的结构基因内包装细胞系中，用于克隆感兴趣的基因的表达载体含有病毒没有结构基因，这既消除了病毒的回复的可能性，并增加了安全与病毒上清工作如没有传染性的病毒粒子产生的 10 。
在这里，我们提出了一个脾B细胞重组逆转录病毒的生产和后续感染的协议。隔离后，刺激培养的脾细胞与钍派生淋巴因子和抗CD40，诱导B细胞的增殖和分化 11爆裂。此协议是为年底发生在B细胞发育和分化，B细胞是从以下初始造血事件，但在抗原刺激诱导浆细胞分化的脾孤立的事件研究的理想。
Protocol
Discussion
这里描述和图1描绘的逆转录病毒转导的脾B细胞是一种遗传性的方法，是在B淋巴细胞的研究非常有用，因为许多lymphopoesis发展的事件是由转录调控1 ，2控制。 ，在B细胞的成熟，通过CD40L的触发，后期是诱导B细胞生长，进入细胞周期， 和增殖11，20所必需的。 如图2所示，B细胞可以在体外刺激抗CD40和IL – 4，经过这一阵扩散，逆转录病毒载体的功能在B细胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK是由哥伦比亚大学的研究生课程。 UB是白血病和淋巴瘤协会的美国，从白血病研究基金会的收件人的新研究者奖的研究员，是由哥伦比亚大学新进教师启动经费支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
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