Produção recombinante Retroviral e infecção de células B
Summary
Um sistema eficiente de estrutura e análise da função de um gene em um<em> Ex vivo</em> Cultura de linfócitos B do baço é descrito. Este método tira proveito da produção recombinante retroviral em uma linhagem de células helper livre, ecotrophic embalagem. Estável, hereditárias expressão de um gene de interesse dentro linfócitos primário é alcançado levando a geração de anticorpos de superfície de células B sofrer recombinação mudança de classe.
Abstract
A expressão de genes transgênicos em células eucarióticas é uma abordagem inversa poderosa genética em que um gene de interesse é expressa sob o controle de um sistema de expressão heteróloga para facilitar a análise do fenótipo resultante. Esta abordagem pode ser usada para expressar um gene que não é normalmente encontrado no organismo, para expressar uma forma mutante do gene de um produto, ou sobre-expressar uma forma dominante negativo do produto do gene. É particularmente útil no estudo do sistema hematopoético, onde a regulação da transcrição é um mecanismo de controle importante no desenvolvimento e diferenciação das células B 1, revisto em 2-4.
Rato genética é uma ferramenta poderosa para o estudo dos genes humanos e doenças. Uma análise comparativa do mouse e do genoma humano revela conservação da sintenia em mais de 90% do genoma 5. Além disso, grande parte da tecnologia usada em modelos do rato é aplicável ao estudo dos genes humanos, por exemplo, interrupções e substituição de genes alelos 6 . No entanto, a criação de um camundongo transgênico requer uma grande quantidade de recursos de natureza financeira e técnica. Vários projetos já começaram a compilar bibliotecas de knock out linhagens de camundongos (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) ou estirpes mutagênese induzida (RIKEN), que exigem esforços em larga escala e de colaboração 7. Portanto, é desejável para o primeiro estudo do fenótipo de um gene desejado em um modelo de cultura celular de células primárias antes de avançar para um modelo de mouse.
Retroviral DNA se integra ao DNA do hospedeiro, de preferência dentro ou perto de unidades de transcrição ou ilhas CpG, resultando em estável e hereditária expressão do gene de interesse embalados, evitando silenciamento transcricional 8 9. Os genes são transcritos, em seguida, sob o controle de um promotor retroviral de alta eficiência, resultando em uma alta eficiência de transcrição e produção de proteína. Portanto, a expressão retroviral pode ser usado com células que são difíceis de transfecção, desde as células estão em um estado ativo durante a mitose. Porque os genes estruturais do vírus estão contidos dentro da linha de célula de embalagem, os vetores de expressão usada para clonar o gene de interesse não contêm genes estruturais do vírus, que tanto elimina a possibilidade de revertentes viral e aumenta a segurança de trabalhar com sobrenadantes viral como não virions infecciosos são produzidos 10.
Aqui apresentamos um protocolo para a produção recombinante retroviral e subseqüente infecção de células B do baço. Após o isolamento, as células cultivadas esplênica são estimuladas com Th linfocinas derivadas e anti-CD40, o que induz a uma explosão de B proliferação e diferenciação celular 11. Este protocolo é ideal para o estudo de acontecimentos ocorridos no final B de desenvolvimento e diferenciação celular, como as células B são isolados do baço seguintes eventos iniciais hematopoéticas, mas antes da estimulação antigênica para induzir a diferenciação plasmocitária.
Protocol
Discussion
Transdução retroviral de células B do baço, como descrito aqui e, conforme ilustrado na figura 1 é uma abordagem genética que é útil no estudo de linfócitos B, porque muitos dos eventos de desenvolvimento em lymphopoesis são controlados pela regulação da transcrição 1, 2. Nos estágios mais avançados da maturação das células B, provocando via CD40L é essencial para a indução de crescimento de células B, a entrada no ciclo celular, e proliferação de 11, 20. C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK é suportado pelo programa de Pós-Graduação da Universidade Columbia. UB é membro da Leukemia and Lymphoma Society of America, o destinatário da New Investigator Award da Fundação de Pesquisa leucemia e é apoiado pela Columbia University New Faculdade start-up fundos.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. . Introduction to Genetic Analysis. , (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
