Heterologous कक्ष में Chemosensory रिसेप्टर्स की सतह अभिव्यक्ति परख
Summary
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए बाहर रहते सेल धुंधला हो जाना है कि HEK293T कोशिकाओं की सतह पर odorant रिसेप्टर्स सुविधा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ले. इसके अलावा, यह भी अन्य chemosensory रिसेप्टर्स या GPCRs की सतह अभिव्यक्ति के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
odors में से ज्वलंत दुनिया olfaction की भावना के द्वारा मान्यता प्राप्त है. चूहों में olfaction के एक प्रदर्शनों की सूची के बारे में 1200 जी प्रोटीन युग्मित (GPCRs) रिसेप्टर्स 1 कि अस्थिर odorant अणुओं बाँध माने हैं और intracellular सिग्नल में जी प्रोटीन Gαolf के साथ युग्मन द्वारा कोशिकी संकेत में परिवर्तित द्वारा मध्यस्थता है. Odorants के रिसेप्टर्स के लिए बाध्य करने के लिए एक मिश्रित नियम है, कि, एक odorant कई रिसेप्टर्स बाँध सकता है और एक रिसेप्टर कई odorants 2 डिग्री बदलती करने के लिए बाध्य कर सकते हैं का पालन करने के लिए सोचा है. सुविधा बायोकेमिकल संकेतन, और ligand बाध्यकारी अध्ययन किया गया है सबसे GPCRs के लिए बाहर ले heterologous कोशिकाओं का उपयोग कर. हालांकि odorant रिसेप्टर्स के अध्ययन के लिए heterologous कोशिकाओं का उपयोग, एक लंबे समय के लिए रोका गया था के बाद से अभिकर्मक पर वे सतह के लिए निर्यात करने में विफल रहा है. Saito एट अल एक झिल्ली से गुजारें प्रोटीन रिसेप्टर (RTP) परिवहन परिवार संरक्षिकाओं घ्राण न्यूरॉन्स संवेदी heterologous कोशिकाओं में सतह, जब सह एक साथ 3 ट्रांसफ़ेक्ट यातायात odorant रिसेप्टर्स संरक्षिकाओं के रूप में कार्य में बढ़ाया अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया है. Heterologous कोशिकाओं का उपयोग रिसेप्टर्स के लिए जैव रासायनिक assays बाहर ले करने के लिए, एक पहले अगर रिसेप्टर सेल लाइन में मजबूत सतह अभिव्यक्ति से पता चलता है यह निर्धारित करना चाहिए. यह निगरानी RTP1S रहते fluorescently कोशिकी डोमेन या बाह्य डोमेन में विशेष रूप से एक टैग लेबल धुंधला सेल द्वारा पीछा के साथ रिसेप्टर्स overexpressing assayed द्वारा किया जा सकता है है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए बाहर रहते सेल धुंधला हो जाना है कि HEK293T कोशिकाओं की सतह पर odorant रिसेप्टर्स सुविधा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ले. इसके अलावा, यह भी अन्य chemosensory रिसेप्टर्स या GPCRs की सतह अभिव्यक्ति के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
हर कदम से बाहर किया जाना चाहिए ध्यान से प्रमुख और विशिष्ट सतह धुंधला हो जाना सुनिश्चित है. पूरे धुंधला प्रक्रिया ठंड में बाहर किया जाना चाहिए (बर्फ पर), और ट्रे कवर फिसल जाता है जिस पर रखी हैं पहले ठंडा कि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Matsunami प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
