从原核文化精简纯化的质粒DNA

Summary

此协议是一个成本效益的替代方案，为高效的并行澄清和质粒DNA纯化<em> E。大肠杆菌</em>文化。 AcroPrep发展的过程开始于一个优化的裂解液澄清过滤净化结合能力高的DNA结合滤板的车牌。

Abstract

我们描述AcroPrep提前96个质粒的准备滤板的完整的过程，从原核文化，并以高纯度的DNA结尾。基于多井过滤细菌裂解液检查和DNA纯化，这种方法创建一个质粒编制的精简过程。含有硅为基础的媒体的过滤板可以很容易地处理，真空过滤或离心产生可观数量的质粒DNA。定量分析确定纯化的质粒DNA是高品质的一贯平均_OD 260/280比值1.97 。总体而言，质粒产量提供更纯净的DNA测序和克隆，下游应用，如。这种简化方法采用AcroPrep提前滤板允许手动，半自动或全自动化处理。

Protocol

1。裂解液间隙成长大肠杆菌改造所需的质粒DNA在深孔板（1毫升文化/）卢里亚肉汤与适当的抗生素一夜之间在37℃用颤抖的彗星的大肠杆菌培养。 佩莱大肠杆菌的培养板在5000 10分钟的XG，然后倒出上清液。 每100μL，再悬浮缓冲液（50毫米的Tris – HCl，pH值8.0，10 mM的EDTA，100微克/毫升RNA酶A）重悬沉淀。 加入100μL/孔裂解液（200毫米氢氧化钠，1％SDS）和摇板振动筛2分钟。 加入100μL/孔和缓冲液（3.0 M醋酸钾，pH值5.5），振摇2分钟。 转移细胞裂解液，裂解液澄清板。 DNA结合的板350μL收集板和成真空歧管底部的地方上。组装真空歧管（见图1）。 裂解液放置澄清真空装置上板。 应用在10英寸汞柱（0.34巴）真空，滤液收集到的DNA结合板。不要使用大于12英寸汞柱真空。 （0.41 bar）的。 拆开真空歧管。将2毫升废物收集板装置的底部。 2。 DNA结合移动的DNA结合板多方面的顶部（见图2）。 加入300μL/孔约束力的缓冲区（6 M盐酸胍）和吸管向上和向下混合。 应用真空〜5英寸汞柱（0.17巴）缓慢真空和丢弃滤液。 DNA是现在势必膜。 与400μL洗涤缓冲液（80％乙醇）/清洗。 应用真空，然后丢弃滤液。如果使用2毫升收集板或过滤直接浪费丢弃不必要的。 重复洗一次。 吸干底部过滤板吸水毛巾擦干。 应用真空一次5-10分钟，以确保去除残留的异丙醇。 吸干底部，以确保去除乙醇滴。 3。 DNA的洗脱添加70μL/孔洗脱缓冲液（10毫米的Tris – HCl，pH值8.0，1毫米EDTA）。如果需要较高的DNA浓度，体积可减少到50μL/孔，但平均总收益率将降低。 一分钟，在室温下孵育板。 可无论是真空或离心洗脱纯化的DNA。 真空法：将清洁的收集板（脱氧核糖核酸酶，核糖核酸酶自由）进入真空系统。放在真空歧管上的过滤板，适用于15英寸汞柱（0.5巴）1分钟真空，直到所有的洗脱缓冲液通过DNA结合板通过。收集纯化后的DNA（见图3）。 离心法：将清洁收集板的顶部和1000 XG 5分钟离心净化过滤板。 4。定量和定性分析测量外径260/280，计算纯化的DNA的浓度。 进行了纯化的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析。 5。代表性的成果 大肠杆菌裂解液澄清使用传统的离心和帕尔AcroPrep提前裂解液澄清过滤板显示的碎片明显减少，从起始原料。 （图4）。 到TE缓冲液中加入三个浓度的质粒DNA，并通过AcroPrep提前裂解液澄清过滤板通过。质粒DNA浓度的比较，前，后过滤，显示在所有三个浓度〜100％的恢复（图5）。 为了证明澄清大肠杆菌的DNA恢复添加到原油裂解大肠杆菌裂解，质粒DNA，然后通过过滤澄清。相同的质粒DNA加入到细胞裂解液以下过滤。电泳是从每个样本（图6）等分。一个单一的，从每个样品类似强度的明确乐队演示一点在澄清过滤步骤如有DNA损失。 文化的E.从 E 大肠杆菌含有PCAT质粒DNA纯化大肠杆菌裂解液使用颇尔公司的350μL和1毫升的DNA结合过滤板，以及两个其他品牌的350μL的DNA结合板。所有纯化制造商建议的协议规定执行。颇尔公司的1毫升AcroPrep进展DNA纯化过滤板（图7和表2）从最高的DNA浓度和总收率。 虽然竞争对手W也显示了DNA浓度高（155毫微克/μL），总DNA的产量是最低的（4.7微克/孔），由于回收量低，〜30微升。竞争者中号了108纳克/μL总产的5.6微克/以及DNA的最低浓度。 洋菜OSE凝胶纯化从三种不同的DNA结合板PCAT DNA分析，如图8所示。每次采集的样本量调整至65μL，以正确的回收量的差异，以电泳前。所有样品超螺旋质粒DNA，但每个滤板的DNA收益率各不相同。 图9显示了所有准备的DNA超螺旋的形式，也有类似的的浓度。 图1。大会歧管的真空裂解液澄清 。 图2。大会的DNA结合真空歧管 。 图3。大会真空歧管真空洗脱。 图4。过滤简化了样品澄清。一式三份样品300μL真空过滤（350微升AcroPrep提前裂解液澄清过滤板）或传统的离心澄清原油裂解。外径320测量之前和之后的澄清。 图5。 PDNA通过后，通过AcroPrep提前裂解液澄清过滤板的全面恢复。 300μLTE缓冲液中添加与PCAT在25，50和100微克/毫升。 DNA浓度和恢复计算外径260过滤前后，N = 2。 图6。 PCAT的DNA后的恢复澄清 。裂解液之前或之后澄清飙升的pUC19相等，则稀释1至10日在TE缓冲液。装2微升/ 1.2％琼脂糖凝胶上的车道。 图7。质粒DNA，每口井产量与PALL Acroprep进展DNA结合比竞争对手板过滤板 。PCAT质粒DNA产量（ 外径 260）使用1毫升（帕尔和竞争对手中号）或1.5毫升（竞争对手宽）过夜培养的指示的DNA纯化板DH5α中。净化用板制造商的推荐协议。误差线表示标准错误（N> 6）。 图8。琼脂糖凝胶电泳分析PCAT的DNA纯化表示DNA结合板 。 1.2％，纯化的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳。由三个独立的净化池的样品，洗脱液净化后，稀释1:10调整至65μL。装2％μL巷。 图9。纯DNA相似的离心或真空方法最终洗脱液收集纯化的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳时的质量和恢复。其次PDNA净化AcroPrep预先过滤板制造商的建议协议。洗脱在1000 XG离心5分钟或2分钟与15英寸汞柱（0.5巴）的真空。

Discussion

我们描述了一个浅显的，精简AcroPrep提前滤板的协议，给予几个优点。在手工，半自动化或全自动化AcroPrep提前格式的处理时，这种方法提供了最大的质粒DNA产量。对裂解间隙板的集成预过滤，提供样品，即使是那些含有较高水平的微粒过滤一致。更快，更均匀，整个板块的滤过率，以最小的滞留量板的结果以及几何;和出口尖几何提供了直接到接收板样品流，无交叉污染的关注。更重要的是，高的DNA结合能力AcroPrep预先过滤板具有约束力板膜是优化高质量的质粒DNA的最大恢复。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
AcroPrep Advance Filter plate		PALL	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 μl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate		PALL	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold		PALL	PN 5017
Vacuum pressure pump		PALL	PN 13157