Summary
Demostración de la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando sondas moleculares PicoGreen tinte y Hitachi F-7000 Espectrofotómetro de fluorescencia equipado con un accesorio lector de microplacas.
Abstract
La cuantificación de ADN, especialmente en pequeñas concentraciones, es una tarea importante con una amplia gama de aplicaciones biológicas incluyendo ensayos estándar de biología molecular como la síntesis y purificación del ADN, las aplicaciones de diagnóstico, tales como la cuantificación de los productos de amplificación de ADN, y la detección de moléculas de ADN en las drogas preparativos. En este video vamos a demostrar la capacidad del espectrofotómetro Hitachi F-7000 de fluorescencia equipado con un accesorio lector de placas Micro para llevar a cabo la cuantificación dsDNA utilizando sondas moleculares Quant-que PicoGreen kit de reactivos de tinte.
El espectrofotómetro de fluorescencia F-7000 ofrece una alta sensibilidad y mediciones de alta velocidad. Es un sistema altamente flexible, capaz de medir la fluorescencia, luminiscencia y fosforescencia. Varios modos de medición están disponibles, incluyendo la longitud de onda de escaneo, el tiempo de exploración, la fotogrametría y la 3-D de medición de análisis. El espectrofotómetro tiene una sensibilidad en el rango de 50 picomoles de fluoresceína cuando se utiliza un volumen de muestra de 300 l en el micro, y es capaz de medir velocidades de escaneo de 60.000 nm / minuto. También cuenta con un amplio rango dinámico de hasta 5 órdenes de magnitud que permite el uso de curvas de calibración en un amplio rango de concentraciones. El sistema óptico utiliza toda la óptica reflectante para la máxima energía y sensibilidad. El rango de longitud de onda estándar es de 200 a 750 nm, y se puede ampliar a 900 nm cuando se utiliza uno de los fotomultiplicadores opcional infrarrojo cercano. El sistema permite el control de temperatura opcional para el lector de placas de 5 a 60 grados Celsius, usando un control de temperatura opcional externa recirculación de líquidos. El lector de microplacas permite el uso de 96 microplacas bien, y la medición de la velocidad de 96 pozos es menos de 60 segundos cuando se utiliza el modo de cinética.
Controles de software para el F-7000 y lector de microplacas son también muy flexible. Las muestras se pueden configurar en cualquiera de los formatos de columna o fila, y cualquier combinación de los pozos pueden ser elegidos para las mediciones de la muestra. Esto permite una utilización óptima de la microplaca. Además, el software permite importar configuraciones de muestra micro placa creada en Excel y se guarda en valores separados por comas, o en formato "csv". Configuraciones de microplacas de medición se pueden guardar y recordar por el software para mayor comodidad y mayor productividad. Resultados de los datos se pueden enviar a un informe estándar, de Excel, o un programa Report Generator opcional.
Protocol
1. Instrumento de configuración
- Encienda el espectrofluorómetro y permitir que se caliente por 1 hora.
- Uso de Excel crea un archivo con las normas y los datos de la muestra, como se muestra en la Figura 1 y guardarlo en valores separados por comas formato "CSV".
Figura 1. Las normas y los datos de las muestras. - Establecer fluorómetro de la siguiente manera:
- Haga clic en el
botón, se abrirá la ventana Método de Análisis, que se muestra en la Fig. 2. 
Figura 2. Análisis ventana del método de la ficha General.
Realice las selecciones siguientes:- En la "medición", seleccione Fotometría del menú desplegable.
- En el "operador", escriba el nombre del operador que sean procedentes.
- No hay necesidad de introducir información en el "instrumento" de campo. Este es seleccionado automáticamente por el software.
- El "muestreo" de campo está inactivo cuando se utiliza el lector de microplacas.
- Introduzca los comentarios que es posible que desee incluir en el informe en el campo "Comentarios".
- En el "accesorio", introduzca la información relacionada con los accesorios utilizados para esta prueba.
- Nota de los botones en la parte derecha de la ventana.
- El botón "Load" permite cargar previamente guardado métodos de análisis.
- El botón "Guardar" permite la actualización de un conjunto de parámetros de prueba o de un método de análisis previamente guardado y cargado, utilizando el mismo nombre.
- La opción "Guardar Como" botón permite guardar un nuevo conjunto de parámetros de prueba o de un método de análisis bajo el nombre que desee.
Figura 3. Análisis de ventana Método, ficha cuantificación.- En el "tipo de cuantificación", seleccione la longitud de onda. Esto indica que la lectura de fluorescencia se realizará mediante la longitud de onda seleccionada.
- En el "tipo de calibración", seleccione una orden de st.
- En el "número de longitudes de onda", seleccione 1.
- En la "unidad de concentración", introduzca ng / mL.
- Deje sin seleccionar las casillas de "Calibración manual" y "Fuerza a través de la curva de cero".
- En el "dígito después del punto decimal", seleccione 2.
- En el "límite inferior de concentración", introduzca 0.
- En el campo "Límite superior de concentración, entre 10.000.
Ahora haga clic en el "Instrumento" y realice los siguientes selecciones.
Figura 4. Método de análisis ventana, pestaña Instrumento- En el "modo de datos:", seleccione fluorescencia.
- La "velocidad de cortar" el campo está inactivo en este momento, sólo se utiliza para las mediciones de la fosforescencia.
- En el "modo de longitud de onda", seleccione fijos WL.
- En el "EX / WL1" escriba 480nm.
- En el "EM / WL1" escriba 520 nm.
- Todos los demás campos de acuerdo con el antiguo y EM están inactivos en este momento.
- En el "corte EX" de selección de campos 5.0nm del menú desplegable.
- En el "EM raja" de selección de campos 5.0nm del menú desplegable.
- Deje sin seleccionar la casilla delante de la "tensión PMT 1-1000V" sobre el terreno.
- En el "voltaje PMT", seleccione 700V desde el menú desplegable.
- En el "Auto Calc estadística. Número" de selección de campos 2.
- En la "Replica" de selección de campos 1.
- En el "Tiempo de integración" de selección de campos 0.1s. </ Li>
- En el "retardo" escriba o seleccione 0.
Figura 5. Método de análisis ventana, en la ficha Monitor.- En el "eje Y", "Max:", seleccione 10000
- En el "eje Y", "Min:", seleccione 0.
- Seleccione la casilla a la izquierda de los "datos abiertos de procesamiento después de la adquisición de datos".
- Deje sin seleccionar la casilla a la izquierda del "Informe de impresión después de la adquisición de datos", a menos que desee un informe que se imprime automáticamente después de las lecturas se han completado.
Figura 6. Ventana de análisis de métodos, informes de tablas.- En la "Salida", seleccione Imprimir informe del menú desplegable. También puede seleccionar "Usar Microsoft Excel" si desea que los datos exportados a Excel, o "Imprimir Hoja de uso del generador" si se utiliza el complemento opcional en el programa generador de informes que permitan la generación de informes personalizados de hecho.
- Haga clic en las casillas de los elementos que desea incluir en el informe.
- Para guardar todos los parámetros seleccionados en las diferentes pestañas de la "Método de Análisis", haga clic de nuevo en la pestaña "General" y guardarlas en un nombre de archivo y en un lugar donde se puede encontrar para su uso futuro, y haga clic en el " Aceptar "para cerrar esta ventana.
- Esto completa el ajuste de los parámetros de prueba del instrumento.
- Ahora vamos a configurar el lector de microplacas.
- Haga clic en el
botón, lo que traerá la ventana de Configuración de TPM en la parte superior.
Figura 7. MPR ventana de Configuración, la ficha de la Plata.- Haga clic en la posición A1 y arrastre el ratón para E1, a continuación, haga clic en el
botón. Se seleccionará las posiciones que se utilizarán para las normas. Esas posiciones se resaltan en color verde. - Ahora tenemos que seleccionar F1 posiciones de H3 para las muestras. Haga clic y arrastre el ratón a partir de la posición de F1, a la posición de H3 y luego haga clic en el
botón, se destacan las posiciones en color amarillo. - A continuación, repita la misma operación para las posiciones de A2 para el E3, para seleccionar las posiciones para las mediciones de la muestra.
- Ahora, vamos a cargar el archivo separado por comas variable (csv) preparado de antemano con las normas y la información de la muestra.
Figura 8. MPR ventana de Configuración, pestaña Información del Pozo.- A continuación, haga clic en el
botón. Una ventana del explorador de Windows se abrirá el cual, como se muestra en la Figura 9, que permitirá localizar el "Bien information.csv" archivo y lo carga. 
Figura 9. Cargando información de la muestra así.
Después de cargar el "Bien de información" del archivo, la "información bien" se verá como se muestra en la Figura 10
Figura 10. Cargado de información muestra.
- Haga clic en el
botón, se abrirá la ventana Método de Análisis, que se muestra en la Fig. 2. 
botón, lo que traerá la ventana de Configuración de TPM en la parte superior. 
botón. Se seleccionará las posiciones que se utilizarán para las normas. Esas posiciones se resaltan en color verde. 
botón, se destacan las posiciones en color amarillo. 
botón. Una ventana del explorador de Windows se abrirá el cual, como se muestra en la Figura 9, que permitirá localizar el "Bien information.csv" archivo y lo carga. 
2. Ensayo Picogreen Preparación de la muestra
- Preparar 1X buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) mediante la adición de 1 ml de tampón 20 X TEa 19 ml dl H 2 O.
- Prepare la solución de Reactivo PicoGreen añadiendo 50 L 200 X reactivo PicoGreen a 9,95 ml de tampón 1 x TE.
- Elaborar normas (Lambda dsDNA) al hacer diluciones seriadas de ADN de doble cadena de valores (100 mg / mL). En primer lugar se prepara una solución de 50 mg / ml dsDNA por la adición de 25 l de ADN de doble cadena de valores (100 mg / mL) y 25 l 1 x tampón TE. A continuación, preparar las soluciones estándar mediante la adición de los volúmenes indicados de ADN de doble cadena y el tampón que se enumeran en la siguiente tabla:
Concentración de ADN de doble cadena Volumen de ADN de doble cadena Volumen de Buffer 1 mg / ml L 20 de 50 ug / ml dsDNA 980 l 1 x tampón TE 0,1 mg / ml 100 L de 1 mg / ml de ADN de doble cadena 900 l 1 x tampón TE 0,01 mg / ml 100 L de 0,1 mg / ml de ADN de doble cadena 900 l 1 x tampón TE 0,001 mg / ml 100 L de 0,01 mg / ml dsDNA 900 l 1 x tampón TE
3. Medición de Estándares y de fluorescencia de muestras
- Pipetear 150 L de cada patrón en los pozos A1-E1 de una placa y 96, por la figura 7, y de acuerdo con la siguiente tabla:
Bien Estándar A1 1 mg / ml B1 0,1 mg / ml C1 0,01 mg / ml D1 0,001 mg / ml E1 1 x tampón TE - Pipeta de 150 muestras l desconocido en los pozos de F1 a H3, que se muestra en la Figura 7
- Vierta la solución PicoGreen preparado en el paso 1.2 en un canal diseñado para su uso pipeta multicanal. Utilice una pipeta multicanal para entregar 150 l solución PicoGreen a los pozos A1-H3. Mezcle la solución y las normas suavemente con una pipeta.
- Coloque la placa en un lugar oscuro y esperar 2-5 minutos para la reacción a desarrollar.
4. Resultados representante
Una buena curva de calibración se evalúa con los diferentes parámetros proporcionados por el software F-7000 en la medición de las normas y el cálculo de la curva de calibración por software.
El coeficiente de determinación indica la bondad del ajuste de los estándares de medida y la curva de calibración calculado. Cuanto más cerca de este valor es "1", el mejor es el ajuste de los valores medidos y la curva de calibración.
Si el valor está lejos de ser "1", las normas deben medirse de nuevo, preparado de nuevo, o cambiar la aptitud de la curva de calibración.
La figura 11 muestra un ejemplo de una curva de calibración con un coeficiente de determinación calculado = 0,99993, que se obtiene para la cuantificación de ADN de doble cadena utilizando PicoGreen tinte.
Figura 11. Ejemplo de curva de calibración de ADN de doble cadena.
Discussion
Pipeteo cuidado durante la preparación de muestras, así como el uso de un espectrofotómetro de fluorescencia estable y sensible es esencial para obtener buenos resultados y reproducible.
En el caso del espectrofotómetro de fluorescencia utilizado para esta prueba, se sugiere con 300 l de volumen final de la muestra en el lector de microplacas. Un menor volumen disminuye la sensibilidad, y un mayor volumen puede causar la contaminación cruzada entre los pozos.
Disclosures
Luis A. Moreno y Kendra L. Cox son empleados de Hitachi Tecnologías de la América del Alto que produce el instrumento utilizado en este artículo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
