Summary

Количественная оценка дцДНК использованием Hitachi F-7000 Флуоресцентный спектрофотометр и PicoGreen Dye

Published: November 05, 2010
doi:

Summary

Демонстрация количественное двухцепочечной ДНК с использованием молекулярных зондов PicoGreen красителя и Hitachi F-7000 флуоресценции Спектрофотометр оснащен аксессуар микропланшетов читателя.

Abstract

Количественная оценка ДНК, особенно в малых концентрациях, является важной задачей с широким спектром биологических приложений, включая стандартные молекулярного анализа биологии, таких как синтеза и очистки ДНК, диагностических приложений, таких как количественная оценка продуктов амплификации ДНК и обнаружение молекул ДНК с наркотиками препаратов. В этом видео мы продемонстрируем возможности Hitachi F-7000 флуоресценции Спектрофотометр оснащен Micro аксессуар чтения пластин для выполнения дцДНК количественного использования молекулярных проб Квант-это PicoGreen красителя реагентов.

F-7000 флуоресценции Спектрофотометр обладает высокой чувствительностью и высоким измерения скорости. Это очень гибкая система, способная измерения флуоресценции, люминесценции и фосфоресценции. Несколько режимов измерений доступны, в том числе длина волны сканирования, время сканирования, фотометрии и 3-D сканирования измерения. Спектрофотометр имеет чувствительность в диапазоне от 50 пикомолей флуоресцеина при использовании 300 мкл объем образца в планшет, и может измерять скорость сканирования 60000 нм / мин. Она также имеет широкий динамический диапазон до 5 порядков, которая позволяет использовать калибровочных кривых в широком диапазоне концентраций. Оптическая система использует все отражающей оптика для максимальной энергии и чувствительности. Стандартный диапазон длин волн от 200 до 750 нм, и может быть расширен до 900 нм при использовании одного из дополнительных ближней инфракрасной фотоумножителей. Система позволяет дополнительно контролировать температуру ридер с 5 до 60 градусов Цельсия с помощью дополнительного внешнего температуры контролируемой жидкости циркулятор. Микропланшетов читателя позволяет использовать 96-а микропланшетов и измерения скорости на 96 лунок составляет менее 60 секунд при использовании режима кинетики.

Программное обеспечение управления для F-7000 и Считыватель микропланшетов также высокой гибкостью. Пробы могут быть установлены либо в столбце или строке форматов, а также любое сочетание скважин могут быть выбраны для выборочных измерений. Это позволяет оптимально использовать планшет. Кроме того, программное обеспечение позволяет импортировать микро образец стекла конфигураций созданных в Excel и сохранить в значения, разделенные запятыми, или "CSV" формат. Микропланшетов измерения конфигурации могут быть сохранены и восстановлены на программное обеспечение для удобства и повышения производительности. Данные результаты могут быть выведены на стандартный отчет, в Excel, или дополнительный Программа генератор отчетов.

Protocol

1. Инструмент установки Включите spectrofluorometer и дать прогреться в течение 1 часа. Использование Excel создать файл с Стандарты и образцы данных, как показано на рисунке 1 и сохранить его в значения, разделенные запятыми "CSV" формат. Рисунок 1. Стандарты и образцы данных. Настройка флуорометр следующим образом: Нажмите на Кнопка, это откроет окно Метод анализа, как показано на рисунке 2. Рисунок 2. Метод анализа окна, вкладка Общие. Сделайте следующие пункты: В "Измерение" поля, выберите Фотометрия из выпадающего меню. В "Оператор" введите имя соответствующего оператора. Существует нет необходимости вводить информацию в "Инструмент" поле. Это выбирается автоматически с помощью программного обеспечения. "Выборка" поле неактивным при использовании микропланшетного. Введите любые комментарии, которые вы можете включить в доклад, в поле "Комментарии". В "Аксессуары" введите информацию о принадлежности, используемые для этого теста. Обратите внимание на кнопки на правой стороне окна. Кнопку "Загрузить" позволяет загружать ранее сохраненные методы анализа. Кнопку «Сохранить» позволяет обновлять набор тестовых параметров или Метод анализа ранее сохранены и загружены, используя те же имя. "Сохранить как" кнопка позволяет сохранить новый набор параметров испытаний или анализа методом под нужное имя. Теперь нажмите на "Количественный" на вкладке, см. рисунок 3 и сделать следующий выбор. Рисунок 3. Метод анализа Window, Количественный вкладке. В "Количественное определение типа" поля, выберите длин волн. Это указывает на то флуоресценции чтении будет выполнено по выбранной длины волны. В "Калибровка типа" поля, выберите 1-го порядка. В "Количество длин волн" поле, выберите 1. В "Концентрация блок" введите нг / мл. Оставьте невыбранной ящики для "Ручная калибровка" и "Форс-кривой, проходящей через ноль". В "цифры после запятой" поля, выберите 2. В "Нижний концентрационный предел" введите 0. В "верхнем поле предельно допустимой концентрации, введите 10000. Теперь нажмите на "инструмент" на вкладке и сделать следующий выбор. Рисунок 4. Метод анализа окна инструментов вкладки В "Данные режим:" поле, выделите флуоресценции. "Рубка скорость" поля неактивны в это время, он используется только для измерения фосфоресценции. В "Длина волны режиме" поля, выберите Оба WL исправлена. В "EX / WL1" введите 480nm. В "ЭМ / WL1" введите 520nm. Все остальные поля под EX и EM неактивны в это время. В "EX щель" поле выбора 5.0nm из выпадающего меню. В «ЭМ щель" поле выбора 5.0nm из выпадающего меню. Оставьте невыбранной поле перед "PMT напряжения 1-1000" поле. В "PMT Voltage" поля, выберите 700V из выпадающего меню. В "известково статистики Auto. Числу" поле выбора 2. В "Репликация" поле выберите 1. В "Время интеграции" поле выбора 0.1с. </ LI> В "Задержка" введите или выберите 0s. Нажмите на вкладку "Монитор". Рисунок 5. Метод анализа окна вкладку Монитор. В "Y оси", "Макс:" поле, выделите 10000 В "Y оси", "Мин:" поле, выберите 0. Установите флажок слева от "Открытого обработки данных после сбора данных". Оставьте невыбранной окне слева от "Печать отчета после сбора данных", если вы не хотите доклад, который будет автоматически печатаются после чтений будут завершены. Нажмите на вкладке "Отчет", см. Рисунок 6. Рисунок 6. Метод анализа окна, Доклад Tab. В "Output" поля, выберите Печать отчета из выпадающего меню. Кроме того, можно выбрать "Использовать Microsoft Excel", если вы хотите, чтобы данные экспортируются в Excel, или «Использовать печати Генератор Ведомости", если с помощью дополнительного добавить на программу генератор отчетов, который позволит генерации пользовательских выступили с докладами. Нажмите ящики для элементов, которые необходимо включить в отчет. Чтобы сохранить все выбранные параметры в разных вкладках "Метод анализа" окно, снова нажмите на вкладку "Общие" и сохранить их под имя файла и в таком месте, где вы могли бы найти их для дальнейшего использования, и нажмите кнопку " ОК ", чтобы закрыть это окно. На этом настройка параметров инструмента тестирования. Теперь мы будем создавать микропланшетов читателя. Нажмите на Кнопка, которая принесет Window MPR установки сверху. Выбор скважин для стандартов и образцов в установке MPR Window / Пластина вкладке, как показано на рисунке 7. Рисунок 7. МПР установки окна, плиты вкладке. Нажмите на позицию А1 и перетащите мышь для E1, а затем нажмите кнопки. Это позволит выбрать позицию для использования в стандартах. Эти позиции будут выделены зеленым цветом. Теперь нам нужно выбрать позицию F1, чтобы H3 для образцов. Щелкните и перетащите мышь, начиная с позиции F1, на позицию H3, а затем нажмите Кнопка, это будет выделить те позиции в желтый цвет. Затем повторите ту же операцию на должности A2 до E3, чтобы выбрать те позиции для образца измерений. Теперь, давайте загрузки файла, разделенных запятыми переменных (CSV) файл подготовлен заранее с Стандарты и образцы информации. Нажмите на "Ну информация" на вкладке "MPR Окно", как показано на рисунке 8. Рисунок 8. МПР установки окна, Ну вкладке Сведения. Затем нажмите на кнопки. Окна Windows Explorer откроет которые, как показано на рисунке 9, который позволит размещения "Ну information.csv" файл и загрузить его. Рисунок 9. Загрузка также информацию образца. После загрузки "Ну информации" файл, "Ну информация" будет выглядеть, как показано на рисунке 10 Рисунок 10. Загружено образца также информации. 2. Picogreen Пробирной пробоподготовки Подготовка 1X ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА), добавив 1 мл 20 X TE буферадо 19 мл ди-H 2 O. Подготовка реагентов PicoGreen Решение добавлением 50 мкл 200 X PicoGreen реагента до 9,95 мл 1 Буфер X TE. Подготовка стандартов (Lambda двухцепочечной ДНК) путем последовательных разведений фондовом двухцепочечной ДНК (100 мкг / мл). Первый приготовить раствор из 50 мкг / мл дц, добавив 25 мкл фондовом двухцепочечной ДНК (100 мкг / мл) и 25 мкл 1 х ТЕ буфера. Затем подготовить стандартные решения, добавив указанные объемы двухцепочечной ДНК и буфер, которые перечислены в таблице ниже: Концентрация двухцепочечной ДНК Объем двухцепочечной ДНК Объем буфера 1 мкг / мл 20 мкл 50 мкг / мл двухцепочечной ДНК 980 мкл 1 X TE буфера 0,1 мкг / мл 100 мкл 1 мкг / мл двухцепочечной ДНК 900 мкл 1 X TE буфера 0,01 мкг / мл 100 мкл 0,1 мкг / мл двухцепочечной ДНК 900 мкл 1 X TE буфера 0,001 мкг / мл 100 мкл 0,01 мкг / мл двухцепочечной ДНК 900 мкл 1 X TE буфера 3. Измерение стандарты и образцы флуоресценции Внесите 150 мкл каждого стандарта в лунки A1-E1 в 96 ячейках, на рисунке 7, и в соответствии со следующей таблицей: Хорошо Стандарт A1 1 мкг / мл B1 0,1 мкг / мл C1 0,01 мкг / мл D1 0,001 мкг / мл E1 1 X TE буфера Внесите 150 мкл неизвестных образцов в лунки F1, чтобы H3, показано на рисунке 7 Налейте PicoGreen раствор, приготовленный в шаге 1,2 в желоб предназначен для многоканальной пипетки использования. Использование многоканальной пипетки доставить 150 мкл решение PicoGreen в лунки А1-H3. Решение Mix и стандартов осторожно пипеткой. Место пластину в темную область и подождите 2-5 минут для реакции на развитие. 4. Представитель Результаты Хороший калибровочной кривой оценивается с помощью различных параметров предоставляемых F-7000 программное обеспечение по измерению стандартов и расчет калибровочной кривой с использованием программного обеспечения. Коэффициент детерминации указывает степень согласия измеренных стандартам и рассчитан калибровочной кривой. Чем ближе это значение на "1", лучше подходят от измеряемой величины и калибровочной кривой. Если значение равно далек от "1", стандарты должны быть переоцениваются, подготовленный еще раз, или фитнес-калибровочной кривой изменился. На рисунке 11 приведен пример калибровочной кривой с расчетной коэффициент детерминации = 0,99993, полученные для количественного определения дцДНК использованием PicoGreen красителя. Рисунок 11. Пример калибровочной кривой двухцепочечной ДНК.

Discussion

Тщательное пипетки во время подготовки проб, а также с помощью стабильной и чувствительной флуоресценции спектрофотометр имеет важное значение для получения хороших и воспроизводимые результаты.

В случае флуоресценции использовали спектрофотометр для этого теста, он предложил использовать 300 мкл конечного объема выборки в микропланшетного. Нижний объем уменьшается чувствительность, и большего объема может привести к перекрестного загрязнения между скважинами.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Distilled H2O Reagent      
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen Reagent   P7589  
Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 Supply   237108  
12 Channel Eppendorf Micropipette Supply   3516677  
1000 μL Eppendorf Pipette Supply      
200 μL Eppendorf Pipette Supply      
10 mL serological pipet Supply      
Aluminum foil Supply      
Pipette tips Supply      
Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 Equipment   5J1-0003  
Microplate Reader Accessory for F-7000 Equipment   5J0-0139  

References

  1. Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).

Play Video

Cite This Article
Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465, doi:10.3791/2465 (2010).

View Video