Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

Summary

O cálcio é um mensageiro onipresente no sistema nervoso, essencial para desencadear a liberação de neurotransmissores e as alterações na força sináptica. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar Ca ^{2 +-indicadores} em terminais nervosos Drosophila. Nós também demonstram a fabricação dos aparelhos necessários e enfatizar os pontos críticos para o sucesso da técnica.

Abstract

Cálcio desempenha muitas funções no sistema nervoso, mas nenhum mais impressionante do que como o gatilho para a liberação do neurotransmissor, e ninguém mais profundo do que como o mensageiro essencial para a plasticidade sináptica que apoie a aprendizagem e memória. Para melhor elucidar as bases moleculares de Ca ^{2 +} dependentes de mecanismos sinápticos, um sistema modelo é necessário que seja geneticamente maleável e fisiologicamente acessível. Drosophila melanogaster fornece um modelo desse tipo. Neste sistema, geneticamente codificados indicadores fluorescentes estão disponíveis para detectar Ca ^{2 +} mudanças nas terminações nervosas. No entanto, estes indicadores têm limitada sensibilidade ao Ca ^{2 +} e muitas vezes mostram uma resposta não linear. Sintética indicadores fluorescentes são mais adequadas para medir a rápida Ca ^{2 +} mudanças associadas com a atividade do nervo. Aqui nós demonstramos uma técnica para carregar dextran-conjugados sintéticos Ca ^{2 +} indicadores em terminais nervosos viver em larvas de Drosophila. Ênfase particular é colocada sobre os aspectos do protocolo mais críticos para o sucesso da técnica, como forma de evitar descargas de eletricidade estática ao longo dos nervos isolados, manter a saúde da preparação durante os períodos de carga estendida, e garantindo a sobrevivência do axônio, fornecendo Ca ^{2 +} para promover a vedação de terminações dos axônios cortados. Baixa afinidade dextran-conjugados Ca ^{2 +-indicadores,} como a fluo-4 e Rhod, estão disponíveis, que mostram uma relação sinal-ruído alta, enquanto minimamente perturbar Ca ^{2 +} pré-sináptica dinâmica. Dextran conjugação-ajuda a prevenir Ca ^{2 +} indicadores sendo seqüestrado em organelas como as mitocôndrias. A técnica de carregamento pode ser aplicado igualmente para as larvas, os embriões e adultos.

Protocol

Selecione um prato de dissecação limpa que não tenha sido exposto a qualquer fixadores. Dissecar um errante 3 º instar larva Drosophila em Meio Schneider Drosophila contendo Ca 2 + e L-glutamina, (não cortar qualquer nervos ou fibras musculares danos n º s 7, 6, 13 ou 12). Selecione um copo de enchimento da pipeta com uma ponta de 12 mícrons (diâmetro interno). Usando uma seringa e tubos (para aplicar pressão negativa para a pipeta) garanti…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma	G1626