Laddar Drosophila nervterminaler med kalcium indikatorer

Summary

Kalcium är en allestädes närvarande budbärare i nervsystemet som är viktiga för att utlösa frisättningen av neurotransmittorer och förändringar i synaptisk styrka. Här visar vi en teknik för laddning Ca ^{2 +-indikatorer} i Drosophila nervändslut. Vi visar också tillverkningen av de erforderliga apparater och understryka punkter kritiska för tekniken framgång.

Abstract

Kalcium spelar många roller i nervsystemet, men ingen mer imponerande än som utlösare för frisättningen av neurotransmittorer, och ingen djupare än som budbärare viktigt för synaptisk plasticitet som stödjer inlärning och minne. För att ytterligare klarlägga den molekylära grunderna för ^{Ca2 +-beroende} synaptiska mekanismer, är en modell som krävs som är både genetiskt formbar och fysiologiskt tillgängliga. Drosophila melanogaster ger en sådan modell. I detta system, genetiskt kodade fluorescerande indikatorer för att upptäcka Ca ^{2 +} förändringar i nervändslut. Har dock dessa indikatorer begränsad känslighet för Ca ^{2 +} och ofta visar en icke-linjär respons. Syntetiska fluorescerande indikatorer är bättre lämpade för att mäta snabba Ca ^{2 +} förändringar i samband med nerv aktivitet. Här visar vi en teknik för laddning dextran-konjugerade syntetiska Ca ^{2 +} indikatorer till levande nerv terminaler i Drosophila larver. Särskild tonvikt läggs på de aspekter av protokollet mest kritiska till tekniken framgång, exempelvis hur man kan undvika statisk elektricitet utsläpp längs den isolerade nerver, bevara hälsan av preparatet under längre lastning perioder, och se till Axon överlevnad genom att ge Ca ^{2 +} för att främja tätning av avhuggna Axon slut. Låg affinitet dextran-konjugerade ^{Ca2 +-indikatorer,} såsom fluo-4 och Rhod, finns tillgängliga som visar ett högt signal-brus-förhållande medan minimalt störa presynaptiska Ca ^{2 +} dynamik. Dextran-konjugering förhindrar Ca ^{2 +} indikatorer som binds in i organeller som mitokondrier. Lastning teknik kan tillämpas lika på larver, embryon och vuxna.

Protocol

Välj en ren dissektion maträtt som inte har varit utsatt för någon fixeringsmedel. Dissekera en vandrande 3: e INSTAR Drosophila larv i Schneiders Drosophila medium som innehåller Ca 2 + och L-glutamin, (skär inte några nerver eller skada muskelfibrer Nos 7, 6, 13 eller 12). Välj ett glas fyllning-pipett med en 12 micron spets (inre diameter). Med hjälp av en spruta och slang (för att tillämpa undertryck på pipett) se till att pipettspet…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma	G1626