Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Summary

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der Progenitorzellen Nische aus der embryonalen Maus-Niere, die verwendet werden, um Signalwege Regulierspindel / Vorläuferzellen des sich entwickelnden Nieren untersucht werden können. Diese kultivierten Zellen sind sehr zugänglich kleines Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die einer effizienten Handhabung von Kandidaten Wege ermöglicht.

Abstract

Embryonalentwicklung der Niere wurde ausgiebig sowohl als Modell für die epithelial-mesenchymale Interaktion in der Organentwicklung und das Verständnis für die Ursprünge der angeborenen Nierenerkrankungen zu gewinnen untersucht. In jüngerer Zeit hat die Möglichkeit der Steuerung naiv embryonalen Stammzellen in Richtung nephrogenen Schicksale in dem aufstrebenden Gebiet der regenerativen Medizin erforscht. Genetische Studien in der Maus haben mehrere Wege für Nieren-Entwicklung erforderlich identifiziert, und einen globalen Katalog der Gen-Transkription in die Orgel wurde vor kurzem generiert http://www.gudmap.org/ und bietet zahlreiche Kandidaten Regulatoren der wesentlichen Entwicklungs-Funktionen. Organogenesis der Nagetier-Niere kann in Organkultur untersucht werden, und viele Berichte haben diesen Ansatz verwendet, um die Ergebnisse der beiden Kandidaten die Anwendung Proteine ​​oder klopfen Sie den Ausdruck von Kandidatengenen mittels siRNA oder Morpholinos analysieren. Allerdings ist die Anwendbarkeit der Organkultur dem Studium der signalisiert, dass Stammzellen / Vorläuferzellen Zelldifferenzierung gegenüber Erneuerung regelt in den Entwicklungsländern Niere begrenzt, da kultivierten Organe einer kompakten extrazellulären Matrix Diffusionsgrenzstrom von Makromolekülen und Viruspartikel enthalten. Um die Zelle Signalwege, die den Stamm / Progenitorzellen Nische in der Niere haben wir eine primäre Zelle, das die nephrogenen Zone oder Progenitorzellen Nische der Entwicklung von Niere ex vivo isoliert von der epithelialen Induktor der Differenzierung schafft entwickelt haben Einfluss zu studieren. Mit begrenzten enzymatische Verdauung, können nephrogenen Zone Zellen selektiv befreit von sich entwickelnden Nieren bei E17.5. Nach der Filtration, können diese Zellen als eine unregelmäßige Monoschicht mit optimierten Bedingungen kultiviert werden. Marker-Gen-Analyse zeigt, dass diese Kulturen eine Verteilung von Zelltypen Merkmal der nephrogenen Zone in vivo enthalten, und dass sie unterhalten geeignete Marker-Gen-Expression während der Kulturzeit. Diese Zellen sind sehr zugänglich für kleine Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die erleichtert das Studium der Kandidat Stamm / Progenitorzellen Regler Effekte. Grundlegende zellbiologische Parameter wie Proliferation und Zelltod sowie Veränderungen in der Expression von molekularen Markern Merkmal Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen in vivo erfolgreich als experimentellen Ergebnissen verwendet werden. Laufende Arbeiten in unserem Labor mit Hilfe dieser neuartigen primären Zelle Technik zielt darauf ab, die grundlegenden Mechanismen für die Regulierung von Selbst-Erneuerung im Vergleich Differenzierung in Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen aufzudecken.

Protocol

1. Vorbereitung Reagenzien für die Nieren Verdauung 1,5 ml 0,25% Collagenase A (w / v) und 1% Pankreatin verdauen (w / v) Lösung zur Extraktion von nephrogenen Zone Zellen (NZCs) von 8 E17.5 Nieren notwendig sein. Da Pankreatin dauert ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur zu lösen, genug zu verdauen Lösung für die größte Zahl von embryonalen Nieren erwarten sollte vor dem Versuch erfolgen. Bereiten Analysenlösung durch erste Zugabe von 25 mg Collagenase A bis 10 ml Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS)…

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem nephrogenen Zone der embryonalen Niere. Es ist die Entwicklung einer Methode zunächst als Teil einer Studie über die Auswirkungen der BMP7 Behandlung auf Zellen des nephrogenen Zone (Blank et al., 2009) veröffentlicht. In der ersten Studie wurden eine Reihe von Experimenten, die Zelltypen innerhalb der NZC Bevölkerung vertreten charakterisieren durchgeführt. Kurz gesagt, Reinigung von NZCs aus genetischen Re…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Watchmaker’s forceps #5		Roboz	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A		Roche	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin		Sigma	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg		Lonza	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)		BioWhittaker	14-901E
HBSS		Gibco	14175
KSFM		Gibco	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM		Sigma	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml		Sigma	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin		BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate		Thermo Scientific	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca		Lonza	17-512F
5mL polystyrene tubes		BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)		Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer		BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde		Sigma	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100		VWR	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS		Sigma	P3813	Supplied as powder
Donkey serum		Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2		Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal		MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin		Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568		Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI		Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield		Vector Laboratories	H-1000
Glycerol		EMD	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit		Qiagen	74004	Use “DNase on column” protocol
Transfer pipettes, 3ml		BD Falcon	357575