배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화
Summary
이 보고서에서 우리는 개발 신장의 줄기 / 전구 세포를 조절 신호 경로를 연구하는 데 사용할 수있는 배아 마우스 신장에서 전구 세포의 틈새의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이러한 교양 세포가 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 또한 중요한 후보 경로의 효율적인 조작을 허용 바이러스 전달에.
Abstract
신장의 배아 개발 광범위 organogenesis의 상피 – mesenchymal 상호 작용을위한 모델로하고 선천성 신장 질환의 기원의 이해를 얻기 위해 두 연구되었습니다. 최근 nephrogenic 운명 향해 순진한 배아 줄기 세포를 핸들의 가능성은 재생 의학의 새로운 분야에서 살펴되었습니다. 마우스의 유전자 연구가 신장 개발에 필요한 몇 가지 경로를 파악해야하고, 장기에서 유전자 전사의 글로벌 카탈로그는 최근 생성되었습니다 http://www.gudmap.org/을 필수 발달 기능의 수많은 후보 레귤레이터를 제공합니다. 쥐 신장의 Organogenesis는 장기 문화를 공부 할 수 있으며, 여러 보고서 중 후보 단백질을 적용하거나 siRNA 또는 morpholinos를 사용하여 후보 유전자의 표현을 쓰러뜨린의 결과를 분석하기 위해이 방법을 사용했습니다. 교양 장기 macromolecules 및 바이러스 입자의 소형 세포외 기질 제한 확산을 포함 그러나 개발 신장에 줄기 / 전구 세포의 차별 대 갱신을 조절 신호의 연구 기관 문화의 적용이 제한됩니다. 우리가 분화의 상피 유도에서 격리 개발 신장 전의 생체내의 nephrogenic 영역 또는 전구 세포의 틈새를 수립 차 전지 시스템을 개발했습니다 신장에서 줄기 / 전구 세포의 틈새에 영향을 미치는 이벤트를 신호 세포를 연구합니다. 제한 효소 소화 사용 nephrogenic 영역 전지는 E17.5에서 신장을 개발로부터 해방 선택하실 수 있습니다. 여과 후,이 세포가 최적의 조건을 사용하여 불규칙한 monolayer로 교양 수 있습니다. 마커 유전자 분석은 이러한 문화가 생체내에 nephrogenic 영역의 특성 세포 유형의 분포를 포함하는 것을 보여줍니다, 그들은 문화의 기간 동안 적절한 마커 유전자 발현을 유지. 이 전지는 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 중요한 것은 역시 크게 후보 줄기 / 전구 세포 조절 효과의 연구를 용이하게 바이러스 전달에. 이러한 증식과 세포 죽음뿐만 아니라 생체내의 nephron의 줄기 / 전구 세포의 특성을 분자 마커의 표현의 변경과 같은 기본적인 세포 생물 학적 매개 변수가 성공적으로 실험 결과로 사용할 수 있습니다. 이 소설 일차 전지 기술을 사용하여 우리 연구실에서 진행중인 작업은 nephron의 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 대 분화의 규정을 관할 기본적인 메커니즘을 발견하는 것을 목표로하고있다.
Protocol
Discussion
이 프로토콜에서는 배아 신장의 nephrogenic 영역에서 세포를 분리하여 문화하는 방법을 설명합니다. 그것은 처음 nephrogenic 영역 (빈 외., 2009)의 세포에 BMP7 치료의 효과에 관한 연구의 일환으로 출판하는 방법의 개발이다. 초기 연구에서는 NZC 인구 내에서 대표 셀 유형을 특성화하기 위해 일련의 실험을 실시했다. (스리 니 바스 외, 2001.; 유 외를, 간단히, 대뇌 피질의 기질 (Foxd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIDDK (LO), 미국 심장 협회 (AB), 스웨덴 및 Kungliga Fysiografiska Sällskapet, 룬드, 스웨덴 (UB)의 웬너 – Gren기구에서 박사 후 장학금에서 R01 DK078161에 의해 지원되었다. 추가 지원은 조직 병리학, 생물 정보학 및 외과를위한 메인 메디컬 센터 연구소의 핵심 시설 (2P20RR18789 – 06 지원)와 MMCRI 동물 시설에 의해 제공되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz | RS-4905 | 2 pairs required | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 578 001 | Wear mask | |
| Porcine Pancreatin | Sigma | P8096 | Wear mask | |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza | 17-513F | With Mg & Ca | |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | ||
| HBSS | Gibco | 14175 | ||
| KSFM | Gibco | 10724-011 | without added growth factors | |
| L-Glutamine 200mM | Sigma | G7513 | Use @ 1% v/v | |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma | P4333 | Use @ 1% v/v | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder | |
| 24 well culture plate | Thermo Scientific | 142485 | Nunclon | |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza | 17-512F | ||
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | ||
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml | |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Use @ 4 % w/v | |
| Triton X100 | VWR | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v | |
| PBS | Sigma | P3813 | Supplied as powder | |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v | |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 | |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 | |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Glycerol | EMD | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use “DNase on column” protocol | |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Falcon | 357575 |
References
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
