Afleiding van thymus lymfoom T-cel-Lines uit Atm - / -</sup En P53 - / -</sup Muizen
Summary
In deze video zien we een protocol om de muis thymus lymfoom cellijnen vast te stellen. Door het volgen van dit protocol, hebben we met succes een aantal T-cellijnen van ATM-/ – en p53-/ – muizen met thymus lymfoom.
Abstract
Gevestigde cellijnen zijn een kritisch onderzoek tool die het gebruik van proefdieren kunnen verminderen in het onderzoek. Bepaalde stammen van genetisch gemodificeerde muizen, zoals ATM – / – en p53 – / – consequent te ontwikkelen thymus lymfoom vroeg in het leven 1,2, en dus kunnen dienen als een betrouwbare bron voor afleiding van muriene T-cellijnen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de ontwikkeling van bestaande muizen thymus lymfoom T-cellijnen zonder de noodzaak om interleukines zoals beschreven in de vorige protocollen 1,3 toe te voegen. Tumoren werden geoogst uit muizen leeftijd van drie tot zes maanden, ten vroegste aanwijzing van zichtbare tumoren gebaseerd op de observatie van de gebogen houding, moeilijke ademhaling, slechte verzorging en verspillen in een vatbare stam 1,4. We hebben met succes een aantal T-cellijnen met behulp van dit protocol en inteeltstammen van ATM – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 en p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 muizen. We verder zien dat meer dan 90% van de gevestigde T-cel populatie CD3, CD4 en CD8 uitdrukt. In overeenstemming met stabiel gevestigde cellijnen, hebben de T-cellen gegenereerd met behulp van het huidige protocol is gepasseerd voor meer dan een jaar.
Protocol
Discussion
In dit protocol, bieden we gedetailleerde procedures voor muriene T-cellijnen te stellen uit twee verschillende muis genotypen; Atm – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] en p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Door het gebruik van dit protocol, een totaal van zes (van de 7 pogingen) Atm – / – en drie (van de 5 pogingen) p53 – / – muizen T-cel-lijnen zijn vastgelegd in ons laboratorium. Representatieve gegeve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Boris Reizis bedanken van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de Columbia University voor nuttige discussies. Willen we ook Dr Margaret Bynoe, Dr Rodman Getchell en Deequa Mahamed bedanken van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan het College of Veterinary Medicine, Cornell University voor technische bijstand met flowcytometrie en Lu Huang voor hulp met video editing. De auteurs willen ook de leden van Duhamel en Weiss laboratoria bedanken voor hun kritische beoordeling van het manuscript en video productie, en Stephanie Yazinski van de Weiss laboratorium voor de fokkerij en genotypering p53 – / – muizen. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Cornell University Institutional Animal Care en gebruik Comite. Dit onderzoek werd mede ondersteund door fondsen die door het Amerikaanse Ministerie van Landbouw, Cooperative State Research, Onderwijs en Extension Service, Animal Health and Disease Research Program (tot GED en RSW) en NIH beurzen R03 HD058220 en R01CA108773 (naar RSW). De video werd geproduceerd met behulp van in-house faciliteiten door het personeel van het Duhamel & Weiss laboratoria.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
- Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
- Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
- Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
- Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).
