Ableitung von Thymuslymphom T-Zell-Linien aus Atm - / -</sup Und P53 - / -</sup Mäuse
Summary
In diesem Video zeigen wir ein Protokoll zur Maus Thymuslymphom Zelllinien zu etablieren. Und p53-/ – – Mäusen mit Thymuslymphom Durch Einhalten dieses Protokolls haben wir erfolgreich mehrere T-Zell-Linien von Atm-/ etabliert.
Abstract
Etablierte Zelllinien sind ein wichtiger Forschungs-Tool, das den Einsatz von Versuchstieren in der Forschung verringern kann. Bestimmte Stämme von genetisch veränderten Mäusen, wie ATM – / – und p53 – / – konsequent zu entwickeln Thymuslymphom früh im Leben 1,2, und damit kann als zuverlässige Quelle für die Ableitung von murinen T-Zell-Linien dienen. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung der etablierten murinen Thymuslymphom T-Zell-Linien, ohne die Notwendigkeit, Interleukine wie in früheren Protokollen 1,3 beschrieben hinzufügen. Die Tumoren wurden von Mäusen im Alter von drei Minuten vor sechs Monaten geerntet, frühestens Hinweis auf sichtbare Tumoren auf der Beobachtung der gekrümmte Haltung basiert, erschwerte Atmung, schlechte Pflege und Verschwendung in einer anfälligen Stamm 1,4. / – – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 und p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 Mäusen Wir haben bereits mehrere T-Zell-Linien mit diesem Protokoll und Inzuchtstämme von ATM gegründet. Wir zeigen ferner, dass mehr als 90% der etablierten T-Zell-Population CD3, CD4 und CD8 ausdrückt. In Übereinstimmung mit stabil etablierten Zelllinien, die T-Zellen, die durch Verwendung der vorliegenden Protokoll generiert seit über einem Jahr wurden passagiert.
Protocol
Discussion
In diesem Protokoll, bieten wir detaillierte Verfahren, um murine T-Zell-Linien aus zwei verschiedenen Maus-Genotypen zu schaffen; Atm – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] und p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Durch dieses Protokoll verwenden, insgesamt 6 (von 7 Versuche) Atm – / – und drei (von 5 Versuche) p53 – / – Maus T-Zell-Linien haben in unserem Labor etabliert. Repräsentative Daten zeigen, dass …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich Dr. Boris Reizis von der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie an der Columbia University danken für hilfreiche Diskussionen. Wir möchten auch Dr. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell und Deequa Mahamed vom Department of Microbiology and Immunology danken an der College of Veterinary Medicine, Cornell University für die technische Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Lu Huang für die Unterstützung bei Videobearbeitung. Die Autoren wollen auch die Mitglieder des Duhamel und Weiss Labors für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Video-Produktion, und Stephanie Yazinski danken aus dem Weiss-Labor für die Zucht und Genotypisierung p53 – / – Mäusen. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Cornell University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschusses durchgeführt. Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel von der US Department of Agriculture, Cooperative State Research, Education, and Extension Service, Animal Health and Disease Research Program (um GED und RSW) und NIH gewährt R03 HD058220 und R01CA108773 (zum RSW) zur Verfügung gestellt unterstützt. Das Video wurde unter Verwendung von in-house Einrichtungen durch das Personal aus dem Duhamel & Weiss Labors.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
References
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