Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

Summary

Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Abstract

Altına almak üzere fonksiyon lenfositler, kan terk ve vücudun farklı dokulara göç etmek gerekir. Endotel hücreleri ve doku ekstravazasyonu Lenfosit yapışır lenfositler ve endotel hücreleri ^{1 2} görüntülenen kendi ligandlar (addressins) ifade farklı adezyon molekülleri tarafından kontrol edilen çok adımlı bir süreç (homing reseptörler). Bu adezyon reseptörlerinin fonksiyon kısmen çalışılan rağmen ex vivo, in vivo lenfosit yapışma ve göç sırasında fizyolojik alaka için nihai test rollerini değerlendirmek için. Intravital mikroskobu (IVM) ve homing deneyler: İki tamamlayıcı stratejiler, bu amaç için kullanılır olmuştur. IVM yapışma kaskad sırasında gerçek zamanlı olarak ve farklı dokularda spesifik adezyon reseptörleri kesin katkısını tanımlamak için gerekli olmasına rağmen, IVM, yoğun zaman alıcı ve emek, genellikle gelişmiş cerrahi tekniklerin geliştirilmesini gerektirir, homojen önceden izolasyon ihtiyacı hücre popülasyonlarının ve herhangi bir zamanda sadece bir doku / organ analizine izin verir. Buna karşılık, rekabetçi homing deneyler aynı fare göç iki (hatta daha fazla) hücre alt direkt ve eş zamanlı karşılaştırma izin verir ve onlar da birçok dokuların ve hücrelerin aynı deneyi bir yüksek sayıda analiz izin.

Burada bir kontrol hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığında belirli dokulara belirli bir hücre tipi avantajı / dezavantajı belirlemek için kullanılan klasik rekabetçi homing protokol açıklar. Bağırsak mukozasının dış çevre ile temas halinde büyük vücut yüzey, çünkü, gut-tropik karşı gut-tropik olmayan T hücreleri göçmen özelliklerini göstermek için seçti ve aynı zamanda iyi tanımlanmış göçmen gereksinimleri ile ekstra-lenfoid doku . Ayrıca son çalışma, vitamin A metabolit all-trans retinoik asit (RA) lenfositler gut-spesifik adezyon reseptörleri (integrin a4b7and kemokin reseptör CCR9) uyarılacak sorumlu başlıca moleküler mekanizma olduğunu belirlemiştir. Bu yüzden, kolayca sonunda, burada açıklanan rekabetçi homing deneylerde kullanılabilecek, sırasıyla, RA varlığı ya da yokluğu T hücreleri aktive ederek, gut-tropik ve lenfositler gut-tropik olmayan ex vivo çok sayıda üretebilirsiniz.

Protocol

1. gut-homing ve kontrol T hücrelerinin ex vivo nesil (bkz. Şekil 1) Vahşi tip farelerin dalak bir ezme splenositlerin izole edin. 5 '400 x g. hücreler PBS içinde süspansiyon ve santrifüj yeniden süspanse Süpernatantı ve kırmızı kan hücreleri, 2-3 dakika için ACK lizis tamponu 4 ml hücre pelletini resuspending lyse. Bundan sonra, 5 ml PBS ekleyin. 400 xg'de 5 'Santrifüj ve supernatant çıkarın. 1 toplam splenositlerin süspanse edin x 10 6 / mL IMDM…

Discussion

Homing deneyler herhangi bir doku toplam hücre popülasyonlarının göç hakkında çok değerli bilgiler sunmak olsa da, bu testlerin doğrudan endotel adezyonu analiz ve bu nedenle ayrımcılık akılda tutulması olmalıdır adımlı yapışma adım (lar) cascade (bağlama / haddeleme, aktivasyon veya yapışmasını) belirli bir homing reseptör davranmaktadır. Yapışma kaskad homing reseptörlerin belirli bir rolü tanımlamak için altın standart, bireysel floresan etiketli T hücreleri (veya hatta floresan i…

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercaptoethanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO₃, 150 mM NH₄Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca⁺⁺ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin – IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).