מסלולי לימוד Cell רולינג על דפוסי קולטן אסימטרית
Summary
אנו מתארים פרוטוקול להתבונן ולנתח מסלולי מתגלגל תאים על מצעים בדוגמת אסימטרית הקולטן. את הנתונים המתקבלים שימושיים ההנדסה של הקולטן בדוגמת מצעים להפרדה-תווית חינם התא ניתוח.
Abstract
תזוזה רוחבית של תאים אורתוגונליים כדי להזרים זרם על ידי גלגול על דפוסי קולטן אסימטרית מהווה הזדמנות לפיתוח של מכשירים חדשים ההפרדה תווית חינם ניתוח של תאים 1. מכשירים כאלה עשויים להשתמש תזוזה לרוחב הפרדה רצוף זרימה, או דפוסי קולטן כי לווסת הידבקות להבחין בין פנוטיפים תאים שונים או רמות של ביטוי הקולטן. הבנת טבעה של מסלולי מתגלגל על קולטן תא בדוגמת מצעים הכרחי ההנדסה של מצעים ועיצוב של מכשירים כאלה.
הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול לחקר מסלולי התא מתגלגל על דפוסי קולטן אסימטרית התומכים הידבקות התא מתגלגל 2. מוגדרים היטב, מיקרומטר בקנה מידה דפוסי P-selectin רצפטורים היו מפוברקות באמצעות הדפסה microcontact על מצופה זהב שקופיות שולבו בחדר זרימה. HL60 תאים המבטאים את ליגנד PSGL-1 3 היו זרמו על פני השדה של קווים בדוגמת ו דמיינו על הפוך מיקרוסקופ שדה בהיר. התאים התגלגל מסומנים בשולי נוטה דפוסים, וכתוצאה מכך סטיה לרוחב 1. כל תא התגלגל בדרך כלל במרחק מסוים לאורך שולי התבנית (כהגדרתו אורך מעקב קצה), מנותקת מן הקצה, והעלה שוב לדפוס במורד הזרם. למרות ניתוק זה מקשה לעקוב אחר מסלול שלם של תא מהכניסה ליציאה בחדר זרימה, חלקיק מעקב התוכנה שימשה לנתח התשואה מסלולי גלגול של התאים בתקופה שבה הם נעים על קולטן אחד בדוגמת קו. מסלולי נבדקו ואז לקבל הפצות של גלגול מהירויות התא אורכי קצה מעקב עבור כל תא של דפוסים שונים.
פרוטוקול זה שימושי לכימות מסלולים תא מתגלגל על דפוסי הקולטן הקשור אלה פרמטרים הנדסיים כגון זווית דפוס מתח גזירה. נתונים אלה יהיה שימושי עבור העיצוב של התקנים microfluidic להפרדת-תווית חינם התא ניתוח.
Protocol
Discussion
תיארנו פרוטוקול לבחון מסלולים מתגלגל על קולטן תא בדוגמת משטחים סימטריים מפוברק באמצעות הדפסה microcontact 2. התמונות מיקרוסקופ אופטי של פני השטח בדוגמת מראה בניגוד ברור בין PEG ו-P-selectin אזורים ניתן להשתמש כדי לאשר הטבעה מוצלחת. שארפ, ישרות ניתן לראות כאשר ביול מבוצע הי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי מרכז Deshpande עבור חדשנות טכנולוגית ב-MIT (ר.ק. ו JMK) ואת אות הקריירה NSF 0952493 עד ר.ק. דרך כימי וביולוגי תוכנית הפרדות. אנו מודים המכון ננוטכנולוגיות חייל (ISN) לבין טכנולוגיה Microsystems מעבדה (MTL) ב-MIT עבור שימוש במתקנים שלהם.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells | |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides | |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG | |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems Inc. | ADP3-050 | P-selectin | |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals, Inc. | BSA-50 | BSA | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech Inc. | 21-030 | DPBS | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | ||
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 .
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
