Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction
Summary
De neuromusculaire junctie (NMJ) van<em> Drosophila melanogaster</em> Is een belangrijk model voor het bestuderen van een normale synaptische functie en storingen aan synaptische functie vinden in bepaalde neurologische aandoeningen. We presenteren een protocol voor dissectie van de<em> Drosophila</em> Larvale motoriek en immunokleuring voor actieve zone eiwitten binnen de NMJ.
Abstract
De Drosophila larven neuromusculaire junctie (NMJ) is een uitstekend model voor de studie van synaptische structuur en functie. Drosophila staat bekend om het gemak van krachtige genetische manipulaties en het larvale zenuwstelsel heeft bewezen vooral nuttig bij het bestuderen van niet alleen de normale functie, maar ook storingen die gepaard gaan met een aantal neurologische aandoeningen (Lloyd en Taylor, 2010). Veel belangrijke synaptische moleculen gevonden in Drosophila zijn ook gevonden in zoogdieren en zoals de meeste CNS synapsen excitatoire in zoogdieren, de Drosophila NMJ is glutamaat en vertoont ook een activiteit-afhankelijke remodeling (Koh et al.., 2000). Bovendien kan Drosophila neuronen worden individueel geïdentificeerd omdat hun innervatie patronen stereotiepe en zich herhalende waardoor het mogelijk is om de vastgestelde synaptische terminals, zoals die tussen neuronen en het lichaam-muur spiervezels dat ze innerveren (Keshishian en Kim, 2004). Bestuderen Het bestaan van evolutionair geconserveerd synaps componenten, samen met het gemak van genetische en fysieke manipulatie maken het Drosophila model ideaal is voor het onderzoek naar de onderliggende mechanismen van synaptische functie (Budnik, 1996).
De actieve zones op synaptische terminals zijn van bijzonder belang, omdat deze zijn de sites van neurotransmitters. NC82 is een monoklonaal antilichaam dat het Drosophila-eiwit Bruchpilot (BRP), een CAST1/ERC familielid, dat is een belangrijk onderdeel van de actieve zone (Wagh et al., 2006). Herkent. BRP bleek direct de vorm van de actieve zone T-bar en is verantwoordelijk voor het effectief clustering Ca 2 +-kanalen onder de T-bar dichtheid (Fouquet et al.., 2009). Mutanten van Brp zijn verminderd Ca 2 + kanaal dichtheid, depressief opgeroepen blaasje release, en veranderde op korte termijn plasticiteit (Kittel et al., 2006).. Wijzigingen in actieve zones zijn waargenomen in Drosophila ziekte modellen. Bijvoorbeeld, immunofluorescentie met behulp van de NC82 antilichaam bleek dat de actieve zone dichtheid was afgenomen in modellen van amyotrofe laterale sclerose en Pitt Hopkins-syndroom (Ratnaparkhi et al., 2008;. Zweier et al., 2009.). Zo kan de evaluatie van actieve zones, of andere synaptische proteïnen, in Drosophila larven van de ziekte van een waardevolle eerste aanwijzing voor de aanwezigheid van een synaptische defect.
Voorbereiden hele-mount ontleed Drosophila larven voor immunofluorescentie analyse van de NMJ vereist enige vaardigheid, maar kan worden bereikt door de meeste wetenschappers met een beetje oefening. Gepresenteerd, is een methode die zorgt voor meerdere larven worden ontleed en immunostained in dezelfde dissectie gerecht, het beperken van het milieu de verschillen tussen elk genotype en zorgen voor voldoende dieren voor vertrouwen in de reproduceerbaarheid en statistische analyse.
Protocol
Discussion
Voor neuronen, de synaptische terminal gebied is van cruciaal belang, en is de brug voor een goede communicatie tussen de post-en pre-synaptische cellen. Een krachtige manier om de gezondheid van het neuron te onderzoeken bij de ziekte van modellen is aan eiwitten van de synaptische terminal te analyseren door immunofluorescentie. De immunofluorescentie methode hier gepresenteerde Hiermee kan de onderzoeker een groot aantal larven tegelijk onderzoeken, terwijl het beperken van de ecologische verschillen tussen de groepe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Nael Alami en Dr Nam Chul Kim voor hun nuttige opmerkingen over dit manuscript.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -. S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
