Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction
Summary
Nöromüsküler bileşke (NMJ)<em> Drosophila melanogaster</em> Normal sinaptik fonksiyonu yanı sıra bazı nörolojik hastalıklar bulunan sinaptik fonksiyon için tedirginlikler eğitimi için önemli bir model sistem. Biz diseksiyonu için bir protokol mevcut<em> Drosophila</emNMJ içinde aktif bölge proteinlerin> larva motor sistemi ve immün.
Abstract
Drosophila larvaları nöromüsküler bileşke (NMJ) sinaptik yapısı ve fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model. Drosophila güçlü genetik manipülasyonlar ve larva sinir sisteminin normal işlev sadece eğitim özellikle yararlı değil, aynı zamanda tedirginlikler kolaylığı için iyi bilinir bazı nörolojik hastalığı (Lloyd ve Taylor, 2010) eşlik ediyor. Drosophilia'daki bulunan birçok anahtar sinaptik moleküller de, memeli canlılarda bulunan ve en çok CNS sinaps eksitatör memelilerde olduğu gibi, Drosophila NMJ glutamaterjik ve aktivite bağımlı remodeling (Koh ve ark, 2000 ) gösteriyor. Innervasyonu desen mümkün motor nöronlar ve vücut duvarı kas lifleri arasında bu gibi tespit sinaptik terminalleri, innerve (Keshishian ve Kim, 2004). Çalışma stereotipik ve yineleyici çünkü Ayrıca, Drosophila nöronların tek tek tespit edilebilir , Birlikte genetik ve fiziksel manipülasyon kolaylığı evrimsel olarak korunmuş sinaps bileşenlerinin varlığı sinaptik fonksiyon (Budnik 1996) altında yatan mekanizmaları araştıran Drosophila modeli ideal hale getirir .
Sinaptik terminallerde aktif bölgeleri, bu nörotransmitter serbest siteleri, çünkü özellikle ilgisini çekmektedir. NC82 Drosophila protein Bruchpilot (BRP), aktif bölgesi (Wagh ve ark, 2006) önemli bir bileşeni olan bir CAST1/ERC aile üyesi tanıyan bir monoklonal antikor. BRP doğrudan aktif bölge T-bar şekline ve etkili bir şekilde Ca 2 kümeleme sorumlu + T-bar yoğunluğu altında kanallar (Fouquet ve ark, 2009). BRP, Mutants azalttı Ca 2 + kanal yoğunluğu, depresif uyarılmış vezikül serbest, ve değişen kısa vadeli plastisite (Kittel ve ark, 2006). Drosophila hastalık modellerinde aktif bölgeleri değişiklikler gözlenmiştir. Örneğin, NC82 antikor kullanarak immünofloresan aktif bölge yoğunluğu Amyotrofik lateral skleroz ve Pitt-Hopkins sendromu (. Zweier ve ark, 2009. Ratnaparkhi ve ark, 2008) modelleri azaldığını gösterdi. Böylece, hastalığın Drosophila larvaları modelleri aktif bölgeleri, ya da diğer sinaptik protein, değerlendirilmesi, sinaptik bir kusurun varlığı için değerli bir başlangıç ipucu verebilir.
NMJ immünofloresan analiz için tüm montaj disseke Drosophila larvaları hazırlanması biraz beceri gerektirir, ama en küçük bir uygulama ile bilim adamları tarafından yapılabilir. Sunan her genotip arasında çevresel farklılıklar sınırlayıcı ve tekrarlanabilirlik güven ve istatistiksel analiz için yeterli hayvanların sağlayan, aynı diseksiyon çanak disseke ve immunohistokimyasal olarak birden fazla larva sağlayan bir yöntem.
Protocol
Discussion
Nöronlar için, sinaptik terminal alanında kritik öneme sahip ve post ve pre-sinaptik hücreleri arasında doğru iletişim için köprü. Nöronun sağlık hastalık modelleri araştırmak için güçlü bir şekilde immünofloresan sinaptik terminal protein analiz etmektir. Burada sunulan immünofloresan yöntemi gruplar arasında çevresel farklılıklar sınırlandırarak araştırmacı aynı anda birçok larva incelemek sağlar. Drosophila üçüncü instar larvaları merkezi sinir sistemi glutamaterjik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Nael Alami ve Dr. Nam Chul Kim bu el yazması konusunda yararlı yorumlar için teşekkür ederim.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -. S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
