Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale
Summary
Une méthode simple et fiable sur l'isolement et la culture des cellules souches neurales à partir des tissus humains jetés corticale du foetus est décrite. Cultures dérivées de humain connu des troubles neurologiques peuvent être utilisés pour la caractérisation des processus cellulaires et pathologiques moléculaires, ainsi que de fournir une plateforme pour évaluer l'efficacité pharmacologique.
Abstract
Les cellules souches neurales (NSC) résident le long de la zone ventriculaire neuroépithélium lors du développement de la plaque corticale. Ces premiers ancêtres de finalement donner naissance à des progéniteurs intermédiaires et plus tard, les divers sous-types de cellules neuronales et gliales qui forment le cortex cérébral. La capacité de générer et de développer NSCs humaine (ce qu'on appelle neurosphères) de tissus fœtaux jetés normale fournit un moyen avec lequel étudier directement les aspects fonctionnels de la normale du développement humain NSC 1-5. Cette approche peut également être dirigée vers la génération de NSC à partir connu des troubles neurologiques, procurant ainsi l'occasion d'identifier les processus pathologiques qui altèrent la prolifération progénitrices, la migration et la différenciation 6-9. Nous nous sommes concentrés sur l'identification des mécanismes pathologiques chez l'homme NSCs syndrome de Down qui pourraient contribuer à l'accélération de phénotype de la maladie d'Alzheimer 10,11. Ni in vivo, ni dans les modèles murins in vitro peut reproduire le répertoire de gènes identiques situés sur le chromosome 21 humain.
Ici, nous utilisons une méthode simple et fiable pour isoler le syndrome de Down NSCs d'humains avortés cortex fœtal et les faire grandir dans la culture. La méthodologie fournit des aspects spécifiques de la récolte des tissus, la dissection des repères anatomiques limitées, tri cellulaire, de placage et repiquage du CNS humaine. Nous fournissons également des protocoles de base pour induire la différenciation des NSCs humains en sous-types de cellules plus sélective.
Protocol
Discussion
Il existe différentes approches envers les tissus de culture frais et la production de lignées cellulaires humaines. Historiquement, les tissus frais a été récolté et mis en culture immédiatement pour générer divers types de cellules dans le système nerveux central. Cette approche est toutefois clairement limité par le nombre d'échantillons qui peuvent être obtenus, qui dans le cas des échantillons humains, est généralement assez faible. Étant donné le degré minimal de la manipulation, fraîchemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par le National Institutes of Health: HD054347 et NS063997-01 à VLS. Ce travail a également été soutenu en partie par le Fonds Empire State de cellules souches par le ministère de l'État de New York contrat Santé # C024324 au VLS. Les opinions exprimées ici sont uniquement celles de l'auteur et ne reflètent pas nécessairement celles du Conseil du Empire State de cellules souches, le New York State Department of Health, ou l'Etat de New York. VLS est un Doris Duke Clinical Scientist Lauréat du Prix du développement. Nous remercions également le professeur Timothy Vartanian pour son don de l'anti-O1, anti-O4 anticorps.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA
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