הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal
Summary
השיטה מבוססת על כימיה המאפשר תיוג, מהיר פולשנית, ויציב של alkyne-tagged glycans עוברי דג הזברה מתואר. Glycans Fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה בשלב מאוחר gastrulation היו הדמיה במחקר זה.
Abstract
Glycans Imaging in vivo לאחרונה מופעל באמצעות אסטרטגיה bioorthogonal הכתב על ידי טיפול כימי בתאים או אורגניזמים עם מונוסכרידים אזיד או alkyne-tagged 1, 2. מונוסכרידים שונה, מעובד על ידי המנגנון biosynthetic glycan, ישולבו glycoconjugates פני התא. תגיות bioorthogonal אזיד או alkyne מכן לאפשר נטיה קוולנטיים עם בדיקות ניאון להדמיה, או עם בדיקות זיקה העשרה ניתוח glycoproteomic. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור הדמיה לא פולשנית של glycans fucosylated עוברי דג הזברה, כולל: 1) microinjection של אחד התאים עוברים שלב עם תמ"ג-5-alkynylfucose (תמ"ג-FucAl), 2) תיוג glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה עם אזיד-מצומדות fluorophores דרך Cu ביולוגית (אני)-catalyzed אזיד-alkyne cycloaddition (CuAAC), ו 3) הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal 3. השיטה המתוארת כאן ניתן להרחיב בקלות לדמיין בסוגים אחרים של glycans, glycans למשל המכילים חומצה sialic 4 ו N-acetylgalactosamine 5, 6, דג הזברה מתפתח בתוך אורגניזמים חיים אחרים.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM093282 אל PW; 3U54AI057158-06S1 כדי RDS) וקרנות ההפעלה של אלברט איינשטיין לרפואה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 |
| Glass bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
