Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal
Summary
Um método baseado em clique química que permite a rotulagem, rápida não invasiva, e robusta de alcino com tags glicanos em embriões de peixe-zebra é descrito. Glicanos Fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish na fase final de gastrulação foram fotografadas neste estudo.
Abstract
Glicanos de imagem in vivo foi recentemente ativado usando uma estratégia repórter bioorthogonal química por tratar células ou organismos com azida ou alcino marcadas monossacarídeos 1, 2. Os monossacarídeos modificado, processados pela máquina biossintética glicano, são incorporados glicoconjugados de superfície celular. As tags bioorthogonal azida ou alcino então permitir a conjugação covalente com sondas fluorescentes para a visualização, ou afinidade com sondas para o enriquecimento e análise glycoproteomic. Este protocolo descreve os procedimentos normalmente utilizados para imagem não invasivos de glicanos fucosylated em embriões de peixe-zebra, incluindo: 1) microinjeção de um celular em embriões em estágio com o PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) rotulagem glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish com azida conjugada fluoróforos via Cu biocompatível (I)-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC), e 3) de imagens por microscopia confocal 3. O método descrito aqui pode ser facilmente estendido para visualizar as outras classes de glicanos, glicanos por exemplo, contendo ácido siálico 4 e N-acetilgalactosamina 5, 6, em zebrafish em desenvolvimento e em outros organismos vivos.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (GM093282 para PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fundos de inicialização do Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 |
| Glass bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C |
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