"Bioluminescent 'Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A
Summary
Um método simples para a identificação de patógenos bacterianos prioridade é a utilização de fagos repórter geneticamente modificadas. Estes fagos repórter, que são específicas para sua espécie de hospedeiro particular, são capazes de transdução rapidamente uma resposta de sinal bioluminescentes para células hospedeiras. Relata-se o uso de fagos repórter para a detecção de<em> Yersinia pestis</em>.
Abstract
Yersinia pestis e Bacillus anthracis Categoria A são bactérias que são os agentes causadores da praga e antraz, respectivamente 1. Embora a ocorrência natural de ambas as doenças "agora é relativamente rara, a possibilidade de grupos terroristas com estes patógenos como uma arma biológica é real. Por causa da comunicabilidade inerente da doença, evolução clínica rápida e alta taxa de mortalidade, é fundamental que um surto ser detectados rapidamente. Portanto metodologias que proporcionam a rápida detecção e diagnóstico são essenciais para garantir a implementação imediata de medidas de saúde pública e ativação de gestão de crises.
Fago recombinante repórter pode proporcionar uma abordagem rápida e específica para a detecção de Y. pestis e B. anthracis. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças atualmente usam os ensaios de lise clássica fago para a identificação confirmada destes patógenos bacterianos 2-4. Estes ensaios aproveitar naturalmente fago que são específicas e lítico para seus hospedeiros bacterianos. Após o crescimento durante a noite da bactéria cultivada na presença do fago específico, a formação de placas (lise bacteriana) fornece uma identificação positiva do alvo bacteriana. Embora estes ensaios são robustos, eles sofrem de três problemas: 1) eles são em laboratório; 2) requerem isolamento bacteriano e cultivo da amostra suspeita, e 3) eles levam 24-36 h para completar. Para tratar dessas questões, fago recombinante repórter "light-com a tag" foram geneticamente modificados através da integração do Vibrio harveyi luxAB genes no genoma de Y. pestis e B. anthracis fago específico 5-8. O fago repórter resultando luxAB foram capazes de detectar o seu alvo específico, rapidamente (em minutos) e com sensibilidade conferir um fenótipo bioluminescentes para células receptoras. Importante, a detecção foi obtido tanto com células cultivadas ou destinatário com mock-infectados amostras clínicas 7.
Para fins de demonstração, aqui descrever o método para a detecção fago-mediada de um Y. conhecida pestis isolar usar um fago repórter luxAB construído a partir da praga CDC diagnóstico fago ΦA1122 6,7 (Figura 1). Um método semelhante, com pequenas modificações (por exemplo, mudança na temperatura de crescimento e media), pode ser usado para a detecção de B. anthracis isola usando o B. anthracis Wβ fago repórter:: luxAB 8. O método descreve a transdução mediada por fagos de um fenótipo biolumescent para Y. cultivada pestis células que são posteriormente medido com um luminômetro. As principais vantagens deste método sobre os ensaios de lise tradicional fago é a facilidade de uso, os resultados rápidos, e a capacidade de testar múltiplas amostras ao mesmo tempo em um formato de placa de 96 poços de microtitulação.
Figura 1. Esquema de detecção. O fago são misturados com a amostra, o fago infecta a célula, luxAB são expressos, e os bioluminesces celular. Processamento da amostra não é necessário; o fago e são misturadas e, posteriormente, medido para a luz.
Protocol
Discussion
Este método demonstra a capacidade do fago repórter para detectar rapidamente Y. pestis desde o fago repórter pode converter uma resposta de sinal bioluminescente para Y. cultivadas pestis células dentro de 20 min após a adição do fago. O fago repórter também é capaz de detectar diretamente Y. pestis em matrizes clínico, sem o pré-requisito de isolamento e cultivo de 7 subseqüente. Em comparação com os ensaios fago padrão de lise, que normalmente exige 48 h …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pequenas Business Innovation Research do National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) e do USDA Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (Nifa, 2009-33610-20028).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Difco LB agar, Miller | VWR | 90003-346 |
| Difco LB broth, Miller | VWR | 90003-350 |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific | 1485-0810 |
| n-Decanal | Sigma | D7384 |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR | 62402-984 |
References
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