"Bioluminescent" Reporter Phage för detektion av kategori A mängden sjukdomsalstrande bakterier
Summary
En enkel metod för identifiering av prioriterade bakterier är att använda genmanipulerade reporter fag. Dessa reporter fag, som är specifika för just deras värdart kan snabbt transducing en självlysande signal svar på värdceller. Häri beskriver vi användning av reportern fag för detektion av<em> Yersinia pestis</em>.
Abstract
Yersinia pestis och anthracis Bacillus är kategori A-bakterier som är smittämnen som pest och mjältbrand, respektive 1. Även naturliga förekomsten av båda sjukdomarna "är nu relativt sällsynt, är möjligheten att terroristgrupper använder dessa patogener som biovapen verklig. På grund av sjukdomen inneboende smittsamhet, snabb kliniskt förlopp och hög dödlighet, är det viktigt att ett utbrott kan upptäckas snabbt. Därför metoder som ger snabb upptäckt och diagnos är en förutsättning för omedelbart genomförande av folkhälsan åtgärder och aktivering av krishantering.
Rekombinant reporter phage kan ge en snabb och specifik metod för detektion av Y. pestis och B. anthracis. Den Centers for Disease Control and Prevention använder för närvarande klassiska analyser fagolys för bekräftade identifiera dessa bakterier 2-4. Dessa analyser dra nytta av naturligt förekommande fag som är specifika och lytisk för bakteriell värdar. Efter natten tillväxt av den odlade bakterien i närvaro av det specifika fag ger bildningen av plack (bakterier lysering) en positiv identifiering av bakterier målet. Även om dessa tester är robusta, lider de av tre brister: 1) de är laboratoriebaserade, 2) de kräver bakteriell isolering och odling från misstänkta provet, och 3) de tar 24-36 timmar att slutföra. För att hantera dessa frågor, var rekombinant "light-märkta" reporter fag genetiskt modifierade genom att integrera Vibrio harveyi luxAB gener i genomet av Y. pestis och B. anthracis specifika phage 5-8. Den resulterande luxAB reporter phage kunde upptäcka sina specifika mål genom att snabbt (inom minuter) och lyhördhet ger en självlysande fenotyp till mottagare celler. Viktigt var detektering fås antingen med odlade mottagaren celler eller med mock-infekterade kliniska prover 7.
För demonstrationsändamål Här beskriver vi metoden för fag-medierad upptäckt av en känd Y. pestis isolera med en luxAB reporter fag konstrueras från CDC pesten diagnostiska fag ΦA1122 6,7 (figur 1). En liknande metod, med smärre modifieringar (t.ex. förändring i tillväxt temperatur och media), kan användas för detektion av B. anthracis isolat med B. anthracis reporter phage Wβ:: luxAB 8. Metoden beskriver fag-medierad transduktion av en biolumescent fenotyp till odlats Y. pestis celler som sedan mäts med en mikroplattor luminometer. De stora fördelarna med denna metod än de traditionella analyser fagolys är enkel att använda, snabba resultat, och möjlighet att testa flera prover samtidigt i en 96-håls mikrotiterplattan format.
Figur 1. Detection schematiska. Blandas med provet The fag, infekterar fag cellen luxAB uttrycks, och bioluminesces cellen. Exempel på behandling inte är nödvändig, den fag och cellerna blandas och därefter för ljus.
Protocol
Discussion
Denna metod visar förmåga reportern phage att snabbt upptäcka Y. pestis sedan reportern phage kan transduce en självlysande signal svar på odlade Y. pestis celler inom 20 minuter efter phage tillägg. Reportern phage är också möjligt att direkt upptäcka Y. pestis i klinisk matriser, utan en förutsättning för isolering och efterföljande odling 7. Jämfört med vanliga tester fagolys som generellt kräver 48 timmar för färdigställande, minskar detta avsevärt det dags …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Small Business Innovation Research program för National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) och USDA National Institute of livsmedels-och jordbruksorganisation (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Difco LB agar, Miller | VWR | 90003-346 |
| Difco LB broth, Miller | VWR | 90003-350 |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific | 1485-0810 |
| n-Decanal | Sigma | D7384 |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. . Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , (2000).
- . . , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. . CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
