Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor
Summary
Wir haben eine zellfreie Rezeptorbindungstest, um die Bindung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) an die Rezeptoren zu schätzen. Es ermöglicht uns, kompetitive Hemmung des biotinylierten GM-CSF-Bindung an löslichen GM-CSF-Rezeptor alpha von GM-CSF Autoantikörper mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit zu bewerten.
Abstract
Hintergrund: Bisher haben wir gezeigt, dass neutralisierende Wirkung, nicht aber die Konzentration von GM-CSF Autoantikörper wurde mit dem Schweregrad der Erkrankung bei Patienten mit Autoimmun-pulmonale Alveolarproteinose (PAP) 1-3 korreliert. Als Aufhebung der GM-CSF-Bioaktivität in der Lunge ist die wahrscheinliche Ursache für Autoimmunerkrankungen PAP 4,5, ist es das Versprechen, die neutralisierende Wirkung des GM-CSF Autoantikörper für die Beurteilung der Schwere der Erkrankung bei jedem Patienten mit PAP zu messen.
Bis jetzt hat neutralisierende Wirkung von GM-CSF-Autoantikörpern durch die Auswertung der Wachstumshemmung von menschlichen Knochenmarkzellen oder TF-1-Zellen mit GM-CSF stimuliert 6-8 bewertet. Im Tierversuch System, jedoch ist es oft problematisch, verlässliche Daten sowie die Daten aus verschiedenen Laboratorien zu vergleichen, aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Zellen in einem konstanten Zustand zu erhalten.
ZIEL: GM-CSF imitieren Bindung an GM-CSF-Rezeptor auf der Zelloberfläche mit zellfreien Rezeptor-Bindungs-Assays.
Methoden: Transgene Seidenraupen-Technologie wurde für den Erhalt einer großen Menge für rekombinante, lösliche GM-CSF-Rezeptor alpha (sGMRα) mit hoher Reinheit 9-13 aufgetragen. Das rekombinante sGMRα war in der hydrophilen Sericin Schichten von Seidenfäden, ohne auf die Seidenproteine verschmolzen enthalten, und somit können wir leicht aus den Kokons in guter Reinheit Extrakt mit neutralen wässrigen Lösungen 14,15. Glücklicherweise sind die Oligosaccharid-Strukturen, die entscheidend für die Bindung mit GM-CSF sind, mehr Ähnlichkeit mit den Strukturen des menschlichen sGMRα als die von anderen Insekten oder Hefen hergestellt.
ERGEBNISSE: Die zellfreien Testsystem mit sGMRα ergaben die Daten mit hoher Plastizität und Zuverlässigkeit. GM-CSF-Bindung an sGMRα war dosisabhängig gehemmt durch polyklonale GM-CSF Autoantikörper in ähnlicher Weise wie die Biotest mit TF-1-Zellen, was darauf hinweist, dass unser neues zellfreien Testsystem mit sGMRα mehr nützlich für die Messung von neutralisierenden Aktivität ist von GM-CSF-Autoantikörpern als der Bioassay-System mit TF-1 Zelle oder menschliche Knochenmarkszellen.
FAZIT: Wir haben einen zellfreien Assay quantifiziert die neutralisierende Kapazität von GM-CSF Autoantikörper.
Protocol
Discussion
Die zellfreien Assay schätzte die neutralisierende Wirkung des GM-CSF-Autoantikörpern mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit und Schnelligkeit. Die Bindung der Hemmung durch GM-CSF Autoantikörper oder Serum des Patienten IgG-Fraktionen wurde durch diesen Test ausgewertet. Die Daten zeigten eine Korrelation zwischen der Bindung Hemmung der zellfreien Assay und die Wachstumshemmung von einem Bioassay mit TF-1 Zellen. Der Bioassay wurde vielfach genutzt, sondern beherbergt Schwierigkeiten beim Vergleich der Daten zwisch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind sehr dankbar, K. Nakagaki, Dr. H. Ishii, Dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa für ihre wertvollen Beiträge.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
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