Un saggio gratuito Cell System Stima della capacità neutralizzante di GM-CSF utilizzando anticorpi ricombinanti solubili GM-CSF Receptor
Summary
Abbiamo progettato una cella priva di test legame recettore al fine di valutare il legame di granulociti-macrofagi colony-stimulating factor (GM-CSF) ai recettori. Ci permette di valutare inibizione competitiva del biotinilato GM-CSF legame al recettore alfa solubili GM-CSF da GM-CSF autoanticorpi con eccellente riproducibilità.
Abstract
SFONDI: In precedenza, abbiamo dimostrato che la capacità di neutralizzare, ma non la concentrazione di GM-CSF autoanticorpi è stata correlata con la gravità della malattia nei pazienti con autoimmuni proteinosi alveolare polmonare (PAP) 1-3. Come abrogazione di GM-CSF bioattività nel polmone è la causa probabile per PAP autoimmuni 4,5, è promettente per misurare la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi per valutare la gravità della malattia in ogni paziente con PAP.
Fino ad oggi, la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi è stata valutata mediante la valutazione della inibizione della crescita di cellule di midollo osseo umano o TF-1 cellule stimolate con GM-CSF 6-8. Nel sistema biologico, tuttavia, è spesso problematico ottenere dati affidabili e di confrontare i dati provenienti da diversi laboratori, a causa delle difficoltà tecniche nel mantenimento delle cellule in una condizione costante.
OBIETTIVO: Per simulare GM-CSF legame con GM-CSF recettore sulla superficie cellulare tramite cell-free recettoriale-test.
METODI: baco da seta transgenici tecnologia è stata applicata per ottenere una grande quantità di ricombinante solubile GM-CSF recettore alfa (sGMRα) con elevata purezza 9-13. Il sGMRα ricombinante era contenuta negli strati sericina idrofila di fili di seta, senza essere fuse alle proteine della seta, e quindi, si può facilmente estrarre dai bozzoli in purezza buona con neutro soluzioni acquose 14,15. Fortunatamente, le strutture oligosaccaridi, che sono critici per il legame con GM-CSF, sono più simili alle strutture di sGMRα umane rispetto a quelle prodotte da altri insetti o lieviti.
RISULTATI: La cella priva di sistema di analisi utilizzando sGMRα dato i dati con elevata plasticità e affidabilità. Vincolanti per sGMRα GM-CSF è stato dose-dipendente inibita da policlonali GM-CSF autoanticorpi in maniera simile al test biologico con cellule TF-1, indicando che il nostro nuovo sistema di test cell-free utilizzando sGMRα è più utile per la misurazione di attività neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi rispetto al sistema biologico utilizzando TF-1 di cellule umane o cellule del midollo osseo.
CONCLUSIONI: Abbiamo stabilito una cella priva di test quantificare la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi.
Protocol
Discussion
Il cell-free saggio stimato la capacità neutralizzante di GM-CSF autoanticorpi con eccellente riproducibilità e rapidità. L'inibizione vincolante da GM-CSF autoanticorpi o frazioni siero del paziente IgG è stata valutata da questa analisi. I dati hanno mostrato una correlazione tra l'inibizione legame della cellula senza test e l'inibizione della crescita di un saggio biologico con cellule TF-1, rispettivamente. Il biologico è stato ampiamente utilizzato, ma nutrito difficoltà inerenti alla comparazion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo molto grati a K. Nakagaki, Dr. H. Ishii, il Dr. K. Suzuki, A. Yamagata, K. Oofusa per i loro preziosi contributi.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog # | Comments |
| human placenta cDNA library | Takara | ||
| Nickel affinity column | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
| biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) | PIERCE | 21339 | |
| rhGM-CSF (leukine) | Genzyme Corporation | ||
| Nunc Immobilizer Amino | Nalge Nunc International | 436007 | |
| Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H1029 | 0.2ml |
| blocking solution (StabilCoat) | Surmodics | SC01-1000 | 1000ml |
| ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate | Invitrogen | 43-8322 | |
| CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II | Applied Biosystems | T2214 | |
| chemiluminescence plate reader | BERTHOLD TECHNOLOGIES | TriStar LB 941 |
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