Summary

A célula do sistema de Ensaio grátis Estimar a capacidade de neutralização de GM-CSF recombinante usando anticorpo receptor GM-CSF Solúvel

Published: June 27, 2011
doi:

Summary

Nós projetamos um ensaio de receptor de células livres vinculativas, a fim de estimar a ligação de granulócitos e macrófagos fator estimulante de colônia (GM-CSF) para os receptores. Ele nos permite avaliar inibição competitiva do biotinilado GM-CSF ligação a solúvel GM-CSF receptor alfa por GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade.

Abstract

FUNDOS: Anteriormente, demonstramos que a capacidade de neutralizar, mas não a concentração de GM-CSF auto-anticorpos foi correlacionada com a severidade da doença em pacientes com proteinose alveolar pulmonar auto-imunes (PAP) 1-3. Como revogação da GM-CSF bioatividade no pulmão é a causa mais provável para PAP auto-imunes 4,5, é promissora para medir a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos para avaliar a gravidade da doença em cada paciente com PAP.

Até agora, a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos foi avaliada através da avaliação da inibição do crescimento de células de medula óssea humana ou TF-1 células estimuladas com GM-CSF 6-8. No sistema de bioensaio, no entanto, muitas vezes é problemático para obter dados fiáveis, bem como comparar os dados de diferentes laboratórios, devido a dificuldades técnicas na manutenção das células em uma condição constante.

OBJETIVO: Para imitar GM-CSF ligação ao GM-CSF receptor na superfície celular utilizando células livres receptor-ensaio de ligação.

MÉTODOS: Transgênicos bicho-da-tecnologia foi aplicada para a obtenção de uma grande quantidade de recombinante solúvel GM-CSF receptor alfa (sGMRα) com alta pureza 9-13. O sGMRα recombinante foi contido nas camadas sericin hidrofílica de fios de seda sem ser fundida ao proteínas da seda, e assim, podemos facilmente extrair os casulos na pureza bom com soluções aquosas neutras 14,15. Felizmente, as estruturas de oligossacarídeos, que são críticos para a ligação com a GM-CSF, são mais semelhantes às estruturas de sGMRα humana do que aquelas produzidas por outros insetos ou leveduras.

RESULTADOS: O sistema de ensaio livre de células usando sGMRα rendeu os dados com alta plasticidade e confiabilidade. GM-CSF ligação a sGMRα foi dose-dependente inibida por policlonal GM-CSF auto-anticorpos de forma semelhante ao bioensaio usando TF-1 células, indicando que o nosso novo livre de células do sistema de ensaio utilizando sGMRα é mais útil para a medição da atividade neutralizante de GM-CSF auto-anticorpos que o sistema de bioensaio utilizando TF-1 célula ou células humanas de medula óssea.

CONCLUSÕES: Nós estabelecemos um ensaio livre de células quantificar a capacidade de neutralização da GM-CSF auto-anticorpos.

Protocol

1. Produção e purificação de sGMRα Amplificar cDNA de sGMRα da biblioteca de cDNA placenta humana por reação em cadeia da polimerase (PCR). Adicionar 50 base de 5'-UTR seqüência de final poliedrina baculovírus e 27 RGS base de codificação Sua tag-de-final 3 'do fragmento amplificado pela PCR por outro PCR. Inserir o produto amplificado de PCR em um pMSG1.1MG plasmídeo. Injetar o psGMR/M1.1MG construir com o vetor helper pHA3PIG em ovos de bicho-da-tensão pn…

Discussion

O ensaio livre de células estimou a capacidade de neutralização de GM-CSF auto-anticorpos com excelente reprodutibilidade e rapidez. A inibição de ligação por auto-anticorpos GM-CSF ou frações de soro do paciente IgG foi avaliada por este ensaio. Os dados mostraram uma correlação entre a inibição de ligação do ensaio livre de células ea inibição do crescimento de um bioensaio utilizando células TF-1, respectivamente. O bioensaio tem sido amplamente utilizada, mas abrigava dificuldades na comparação …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muito gratos a K. Nakagaki, H. Dr. Ishii, Dr. K. Suzuki, Yamagata A., K. Oofusa por suas valiosas contribuições.

Materials

Name of reagent Company Catalog # Comments
human placenta cDNA library Takara
Nickel affinity column GE Healthcare 17-5247-01
biotin hydrazide (EZ-Link Biotin Hydrazide) PIERCE 21339
rhGM-CSF (leukine) Genzyme Corporation
Nunc Immobilizer Amino Nalge Nunc International 436007
Monoclonal Anti-polyHistidine antibody produced in mouse Sigma-Aldrich H1029 0.2ml
blocking solution (StabilCoat) Surmodics SC01-1000 1000ml
ZyMAX Streptavidin-AP Conjugate Invitrogen 43-8322
CDP-Star Ready-to-Use With Sapphire-II Applied Biosystems T2214
chemiluminescence plate reader BERTHOLD TECHNOLOGIES TriStar LB 941

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Urano, S., Tazawa, R., Nei, T., Motoi, N., Watanabe, M., Igarashi, T., Tomita, M., Nakata, K. A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor. J. Vis. Exp. (52), e2742, doi:10.3791/2742 (2011).

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