عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل
Summary
ووصف طريقة سريعة للحصول على الكريات البيض التسلل من الدماغ الفئران. هذه الطريقة تستخدم الانحدار المستمر والمتقطع Percoll التدرج Ficoll لتحديد وتنقية طبقة الكريات البيض المخصب. ثم قد تكون معزولة الكريات البيضاء التي تتميز قياسات تدفق cytometric.
Abstract
نحن تصف طريقة لإعداد الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs) من الفئران. نحن لشرح كيفية تصيب الدماغ و النخاع الفئران مع فيروس تايلر الفئران (TMEV) عبر تقنية الحقن داخل الجمجمة السريع ، وكيفية تنقية سكان الكريات البيض المخصب من الخلايا التسلل من الدماغ كله. باختصار ، هي تخدير الفئران مع isoflurane في غرفة مغلقة وخالية من ناحية حقن حقنة مع هاميلتون في القشرة الأمامية. ثم يتم قتل الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى عن طريق جرعة زائدة isoflurane والعقول كلها تستخرج والمتجانس في RPMI مع طاحونة Tenbroeck الأنسجة. وطرد الخليط الدماغ من خلال التدرج المستمر Percoll 30 ٪ لازالة الانقاض الخلية الميلين وغيرها. وتوترت ثم تعليق خلية في 40 ميكرون ، وغسلها وطرد على التدرج متقطع بلس Ficoll – Paque لتحديد وتنقية الكريات البيض. ثم يتم غسل الكريات البيض ومعلق في مخازن مناسبة لimmunophenotyping بواسطة التدفق الخلوي. التدفق الخلوي يكشف عن مجموعة من الخلايا المناعية الفطرية في المراحل المبكرة من العدوى في الفئران C57BL / 6. إصابة آخر في 24 ساعة ، مجموعات فرعية متعددة من الخلايا المناعية الموجودة في BILs ، مع السكان المخصب من GR1 + ، + CD11b وخلايا + F4/80. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة في وصف رد الفعل المناعي للعدوى حادة في الدماغ.
Protocol
Discussion
نستخدم التدفق الخلوي بشكل روتيني لتحديد كلا من نوعية الخلية إعداد الدماغ التسلل ، والتمييز مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية 2 و 9. في نقطة زمنية حادة ، لدينا أسلوب BILs غلة نسب عالية من التهابات داخل حيدات السكان CD45hi فضلا عن النسب العالية من السكان في الضامة CD45lo….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منحة من NS64571 NINDS (CLH) ، عن طريق منح التطوير الوظيفي في وقت مبكر من مايو كلينيك (CLH) ، وبواسطة هبة سخية من دونالد وفرانسيس Herdrich (CLH) نود أن نشكر تدفق مايو كلينيك الأساسية الخلوي للحصول على المساعدة.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. . B. r. o. w. n., , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler’s virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
