브레인 - 침투 Leukocytes의 분리
Summary
murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 – 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.
Abstract
우리는 생쥐의 두뇌 침투 leukocytes (BILs)를 준비하는 방법을 설명합니다. 우리는 어떻게 뇌 전체에서 침투 세포 백혈구 – 풍부한 인구를 정화하기 위해 신속한 intracranial 분사 기술과를 통해 Theiler의 murine encephalomyelitis 바이러스 (TMEV)와 마우스를 감염하는 방법을 보여줍니다. 간단히 마우스는 닫힌 챔버에서 isoflurane과 anesthetized되며 전두엽 피질에 해밀턴 주사기로 주입 자유 손으로입니다. 생쥐는 다음 Tenbroeck 조직 분쇄기로 RPMI에서 추출하여 균질 아르 isoflurane 과다 복용과 전체 뇌 감염 후 여러 시대에서 살해되었습니다. 두뇌 homogenates은 myelin 및 기타 세포 파편을 제거하는 연속 30 % Percoll 기울기를 통해 centrifuged 수 있습니다. 세포 현탁액은 다음 40 μm의에서 긴장 세탁 및 leukocytes을 선택하고 정화하는 불연속 Ficoll – Paque 플러스 기울기에 centrifuged 있습니다. leukocytes 그런 다음 세탁 및 유동세포계측법에 의해 immunophenotyping에 적합한 버퍼에 resuspended 있습니다. 유동세포계측법가 C57BL / 6 생쥐에 감염의 초기 단계에 타고난 면역 세포의 인구를 보여줍니다. 24 시간 이후 감염에서 면역 세포의 여러 하위 집합은 Gr1 +, CD11b +와 F4/80 + 세포의 풍부한 인구와 BILs에 존재한다. 따라서,이 방법은 두뇌의 급성 감염에 대한 면역 반응을 특성화에 유용합니다.
Protocol
Discussion
우리는 정기적으로 뇌 세포 침투 준비의 품질 모두를 결정하는 유동세포계측법를 사용하고, 면역 세포, 2, 9의 다른 인구를 구별합니다. 급성 시간 지점에서 우리 BILs 메서드는 CD45hi 인구뿐만 아니라 CD45lo 인구의 macrophages 높은 비율 이내에 염증 monocytes의 높은 비율을 산출. 이것은 두뇌 속에 재현할 면역 반응이 견고하게 우리의 방법을 특징으로 할 수 없음을 나타냅니다.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 메이요 클리닉 (CLH)에서 조기 경력 개발 보너스로, NINDS (CLH)에서 부여 NS64571 지원하고, 도널드와 프랜시스 Herdrich (CLH)에서 후한 선물로.했습니다 우리는 도움을 메이오 클리닉 유동세포계측법 코어를 감사하고 싶습니다.
Materials
| Reagent | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder | Fisher | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Falcon | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| sodium azide | Sigma | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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