murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.
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방법 논문
브레인 - 침투 Leukocytes의 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
우리는 생쥐의 두뇌 침투 leukocytes (BILs)를 준비하는 방법을 설명합니다. 우리는 어떻게 뇌 전체에서 침투 세포 백혈구 - 풍부한 인구를 정화하기 위해 신속한 intracranial 분사 기술과를 통해 Theiler의 murine encephalomyelitis 바이러스 (TMEV)와 마우스를 감염하는 방법을 보여줍니다. 간단히 마우스는 닫힌 챔버에서 isoflurane과 anesthetized되며 전두엽 피질에 해밀턴 주사기로 주입 자유 손으로입니다. 생쥐는 다음 Tenbroeck 조직 분쇄기로 RPMI에서 추출하여 균질 아르 isoflurane 과다 복용과 전체 뇌 감염 후 여러 시대에서 살해되었습니다. 두뇌 homogenates은 myelin 및 기타 세포 파편을 제거하는 연속 30 % Percoll 기울기를 통해 centrifuged 수 있습니다. 세포 현탁액은 다음 40 μm의에서 긴장 세탁 및 leukocytes을 선택하고 정화하는 불연속 Ficoll - Paque 플러스 기울기에 centrifuged 있습니다. leukocytes 그런 다음 세탁 및 유동세포계측법에 의해 immunophenotyping에 적합한 버퍼에 resuspended 있습니다. 유동세포계측법가 C57BL / 6 생쥐에 감염의 초기 단계에 타고난 면역 세포의 인구를 보여줍니다. 24 시간 이후 감염에서 면역 세포의 여러 하위 집합은 Gr1 +, CD11b +와 F4/80 + 세포의 풍부한 인구와 BILs에 존재한다. 따라서,이 방법은 두뇌의 급성 감염에 대한 면역 반응을 특성화에 유용합니다.
프로토콜
1. Intracranial 바이러스 주입 :
다음 기술은 수정 및 실험실 및 동료에 의해 광범위하게 활용되었습니다. 간단히, Theiler의 murine encephalomyelitis 바이러스 (TMEV) 또는 사기 - 감염의 다니엘의 변형의 intracranial 주입 (1, 10) 뇌 침투 leukocytes (BILs)를 이끌어내는 젊은 생쥐 (세 선호 5-6주)에 수행됩니다. 결과는 다니엘의 변형, 콩 변형 및 GDVII 스트레인 다를됩니다. BILs을 수확하기위한 목적으로, 생쥐는 TMEV의 2x10 5 PFU을 받고 24 시간 동안 감염됩니다.
- 자동 1 ML 해밀턴 주사기로 (27 게이지, ¼ 켄달에) 주입 바늘을 첨부 및 바이러스 10 μl를 제공하기 위해 설정할 수 있습니다.
- 공기 방울에 세심한주의와 주사기에 10 μL DMEM에 TMEV을 그립니다. 경우 적절한, 가짜 감염된 생쥐는 바이러스가없는 DMEM 10 μl를 받게됩니다.
- 직전 주사로, 아래 면화 기판과 전선 격자를 포함하는 벨 항아리에 isoflurane의 약 1 ML 잔.
- 발가락 - 핀치에 무심하고 흡입 마취에 의해 고정화 벨 병 속에 와이어 그리드에 자리 마우스....
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토론
우리는 정기적으로 뇌 세포 침투 준비의 품질 모두를 결정하는 유동세포계측법를 사용하고, 면역 세포, 2, 9의 다른 인구를 구별합니다. 급성 시간 지점에서 우리 BILs 메서드는 CD45hi 인구뿐만 아니라 CD45lo 인구의 macrophages 높은 비율 이내에 염증 monocytes의 높은 비율을 산출. 이것은 두뇌 속에 재현할 면역 반응이 견고하게 우리의 방법을 특징으로 할 수 없음을 나타냅니다.
이 기술은 마우스의 두뇌에서 면역 세포를 잘 특징 인구를 필요로 실험을 위해 특히 중요하다. 우리는 이전에 꼬리 정맥 주사 7을 통해 호스트 마우스에 leukocytes에 침투해 우리의 두뇌를 주사하여 입양 전송 실험을 수행 있고, 우리는 체외 실험 9 여러 통해 BILs를 묘사했습니다. 우리 BILs 준비는 주민 macrophages과 microglia을 포함하여 두뇌의 거주 세포에서 면역 세포의 다.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 메이요 클리닉 (CLH)에서 조기 경력 개발 보너스로, NINDS (CLH)에서 부여 NS64571 지원하고, 도널드와 프랜시스 Herdrich (CLH)에서 후한 선물로.했습니다 우리는 도움을 메이오 클리닉 유동세포계측법 코어를 감사하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| TMEV | 하우 랩 | N / A | |
| 다니엘의 변형 | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| 둥근 바닥 오크 리지 원심 분리기 튜브 | Nalgene | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE 헬스케어 | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | 로체 | 11666789001 | |
| Ficoll - Paque 플러스 | GE 헬스케어 | 17-1440-02 | |
| Trypan 블루 0.4 % (W / V) | Mediatech | 25-900 - CI | |
| 15 ML 원뿔 튜브 | BD 팰컨 | 352097 | |
| 7 ML 유리 Pyrex 브랜드 Tenbroeck 조직 연삭기 | 어부 | 08-414 - 10B | |
| 40 μm의 셀 스트레이너 | BD 팰컨 | 352340 | |
| 50 ML 원뿔 | BD 팰컨 | 352070 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A9647 | |
| 나트륨 azide | 시그마 | S8032 | |
| CMF - PBS | Mediatech | 21-040 - CV | |
| 외과 튜브 | BD 팰컨 | 352054 | |
| 태아 소 혈청 | 시그마 | F4135 | |
| 2.4G2 하이 브리 도마 | ATCC | HB - 197 | |
| 코스타 V - 바닥 플레이트 | 코닝 | 3894 | |
| 알레 그라 X - 22R 원심 분리기 또는 동급 | 베크맨 | N / A | |
| 96 - 웰 플레이트 양동이와 로터 | 베크맨 | S2096 | |
| 고정 앵글 로터 | 베크맨 | F0360 | |
| paraformaldehyde | 시그마 | P6148 | |
| BD 외과 Calibur | BD Biosciences | N / A | |
| FlowJo 7.5 | 트리 스타 (주) | N / A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | 클론 : 30 - F11 |
| Gr1 (Ly6C / G) | BD Biosciences | 553128 | 클론 : RB6 - 8C5 |
| CD11b | ebiosciences | 17-0112-83 | 클론 : M1/70 |
| F4/80 | ebiosciences | 17-4801-82 | 클론 : BM8 |
참고문헌
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein,....
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