すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ
Summary
シンプルなスロットブロット法は、バイオインフォマティクス解析によって同定された彼らの最も保存された配列を標的とする普遍的な抗体を用いてインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量化のために開発されました。この革新的なアプローチは、すべてのウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量に有用な代替手段を提供することがあります。
Abstract
ヘマグルチニン（HA）とノイラミニダーゼ（NA）はウイルスのライフサイクルと防御免疫反応の1,2の誘導に重要な役割を果たすことが知られているインフルエンザウイルスの2つの表面蛋白質である。中和抗体の主要なターゲットとして、HAは現在、インフルエンザワクチンの効力のマーカーとして使用され、一元放射免疫拡散（SRID）3によって測定されます。しかし、対応するサブタイプ特異的抗血清の可用性にSRIDの依存性はすべての新しいワクチンのリリースのための2-3ヶ月の遅延の最小値になります。また、NAにも防御免疫4を誘発するという証拠にもかかわらず、インフルエンザワクチンのNAの量がまだのために適切な試薬や分析法5の欠如に標準化されていません。このように、HAとNA抗原を定量することができるシンプルな代替方法は、Rapid Releaseとインフルエンザワクチンのよりよい品質管理のための望ましいです。
すべての利用可能なインフルエンザのHAとNAの配列における普遍的に保存された領域は、6月7日バイオインフォマティクス解析により同定した。つの保存配列はノイラミニダーゼ、一酵素活性部位に近い（HCA – 2として指定）とで識別されたうちの一方のシーケンスは、（ユニ- 1として指定）、HA、融合ペプチド6の唯一の普遍的に保存さエピトープが同定されたN -末端に他の近くに（HCA – 3として指定）7。これらのアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、抗体の産生のためにウサギを免疫するために使用された。 HAのユニ- 1エピトープに対する抗体は、HCA – 2とNAのHCA – 3の領域に対する抗体は、全9 NA亜型を結合することが可能であった間にインフルエンザHA（H1 – H13）の13サブタイプに結合することができた。尿膜タンパク質との交差反応性が検出されなかったことを観察によって証明されるようにすべての抗体は、ウイルス配列に対して顕著な特異性を示した。これらの普遍的な抗体は、特異的抗血清7,8がなくてもインフルエンザワクチンのHAとNAを定量化するためにスロットブロットアッセイを開発するために使用されていました。ワクチンのサンプルは、種々の濃度に希釈した標準品と一緒にスロットブロット装置を用いてPVDF膜に適用した。 HAの検出のために、サンプルと標準は、最初に希釈したトリス緩衝NAの測定のために彼らはこれらの条件としてZwittergent 0.01％を含むTBSで希釈しながら、4M尿素を含有する生理食塩水（TBS）が有意に検出感度を向上した。それぞれの普遍的な抗体でイムノブロットすることによって、HAとNAの抗原の検出に続いて、信号強度はデンシトメトリーにより定量した。ワクチンのHAとNAの量は、使用される参照の種々の濃度の信号強度と確立された標準曲線を用いて計算した。
これらの抗体は、HAまたはNAのユニバーサルエピトープに結合することを考えると、関心のある研究者は、スロットブロット以外のイムノアッセイで研究ツールとしてそれらを使用することができます。
Protocol
Discussion
これら2つの表面のタンパク質が免疫応答の6-11を誘発する最も重要なウイルス成分なので、インフルエンザウイルスのHAとNAの定量は、ワクチンの研究開発にとって重要です。これらのタンパク質の検出のための以前に報告された免疫学的方法は、歪みの特定の抗体が必要です。抗体は彼らの唯一の普遍的に保存されたエピトープ6-8を認識するので、HAとNAの抗原ここで説明を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿の編集審査のために夫人モニカTocchiに感謝したいと思います。 AMHは、カナダにおけるサウジアラビアの文化局を通じて、キングアブドゥルアジーズ大学からの奨学金によってサポートされています。
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
References
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