El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot
Summary
Un método sencillo slot blot fue desarrollado para la cuantificación de la hemaglutinina y la neuraminidasa viral de la gripe utilizando anticuerpos universales dirigidas a sus secuencias más conservadas identificados a través de análisis de la bioinformática. Este enfoque innovador puede ofrecer una alternativa útil para la determinación cuantitativa de todos los hemaglutinina y la neuraminidasa viral.
Abstract
Hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) son dos proteínas de superficie de los virus de influenza que se sabe que juegan un papel importante en el ciclo de vida viral y la inducción de respuestas inmunes protectoras 1,2. Como el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes, HA se utiliza actualmente como el marcador de potencia de la vacuna de la gripe y se mide por inmunodifusión radial simple (SRID) 3. Sin embargo, la dependencia del SRID de la disponibilidad de los antisueros correspondientes subtipos específicos de las causas de un mínimo de 2-3 meses de retraso para la liberación de todas las nuevas vacunas. Por otra parte, a pesar de la evidencia de que NA también induce inmunidad protectora 4, la cantidad de NA en vacunas de la gripe aún no está estandarizado debido a la falta de reactivos adecuados o métodos de análisis 5. Por lo tanto, simples métodos alternativos capaces de cuantificar los antígenos HA y NA son deseables para una liberación rápida y un mejor control de calidad de vacunas contra la influenza.
Regiones universalmente conservadas en todos los de la gripe A disposición de HA y NA secuencias fueron identificados por análisis de la bioinformática 6-7. Una secuencia (designado como Uni-1) fue identificado en el epítopo sólo universalmente conservadas de la HA, el péptido de fusión 6, mientras que dos secuencias conservadas fueron identificados en neuraminidasa, una cerca del sitio activo enzimático (designado como HCA-2) y el otra cerca de la N-terminal (designado como HCA-3) 7. Péptidos con estas secuencias de aminoácidos fueron sintetizados y utilizados para inmunizar a los conejos para la producción de anticuerpos. El anticuerpo contra el epítopo Uni-1 de HA fue capaz de obligar a 13 subtipos de influenza A-HA (H1-H13), mientras que los anticuerpos contra el HCA-2 y HCA-3 regiones de NA fueron capaces de unirse a los 9 subtipos de NA. Todos los anticuerpos mostraron especificidad notable contra las secuencias virales como lo demuestra la observación de que sin reactividad cruzada con las proteínas alantoideo fue detectado. Estos anticuerpos universales fueron utilizados para desarrollar los ensayos de slot blot para cuantificar la HA y NA de la gripe A vacunas sin la necesidad de antisueros específicos 7,8. Muestras de la vacuna se aplica en una membrana de PVDF utilizando un aparato de slot blot, junto con las normas de referencia diluido a diferentes concentraciones. Para la detección de HA, muestra y el patrón se diluye primero en Tris-buffer salino (TBS), que contiene urea 4M, mientras que para la medición de NA que se diluyeron en TBS que contiene 0,01% Zwittergent ya que estas condiciones mejora significativamente la sensibilidad de detección. Tras la detección de los antígenos HA y NA por inmunotransferencia con sus respectivos anticuerpos universales, la intensidad de señal se cuantificaron por densitometría. Las cantidades de HA y NA de las vacunas fueron calculados utilizando una curva estándar establecida con la intensidad de la señal de las distintas concentraciones de las referencias utilizadas.
Dado que estos anticuerpos se unen a epítopos universal en HA o NA, los investigadores interesados puedan utilizarlos como herramientas de investigación en los inmunoensayos que no sea el slot blot solamente.
Protocol
Discussion
La determinación cuantitativa de la influenza viral HA y NA son críticos para la investigación y desarrollo de vacunas ya que estas dos proteínas de superficie son los componentes virales más importantes de inducir respuestas inmunes 06.11. Se informó anteriormente los métodos inmunológicos para la detección de anticuerpos contra estas proteínas requieren cepa específica. El método de ranura mancha simple, reproducible y rápido para cuantificar los antígenos HA y NA aquí descritos son adecuados…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a la Sra. Monika Tocchi para la revisión editorial del manuscrito. AMH es apoyado por una beca de la Universidad King Abdulaziz, de Arabia Saudita a través de la Oficina Cultural de Canadá.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
References
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