Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot
Summary
En enkel slot Blot-teknik har utvecklats för kvantifiering av influensa virus hemagglutinin och neuraminidas med universella antikroppar riktade sina mest bevarade sekvenser identifierats genom bioinformatik analyser. Detta innovativa tillvägagångssätt kan ge ett användbart alternativ till kvantitativ bestämning av alla virala hemagglutinin och neuraminidas.
Abstract
Hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) är två ytproteiner av influensavirus som är kända för att spela viktiga roller i virusets livscykel och induktion av skyddande immunsvar 1,2. Som det främsta målet för neutraliserande antikroppar är HA idag används som influensavaccin styrkan markör och mäts genom en enda radiell immunodiffusion (SRID) 3. Däremot orsakar beroende av SRID på tillgången på motsvarande subtyp-specifika antiserum minst 2-3 månader försening för frisläppandet av varje nytt vaccin. Dessutom, trots bevis på att NA också inducerar skyddande immunitet 4, mängden NA i influensavacciner är ännu inte standardiserad på grund av brist på lämpliga reagenser eller analytisk metod 5. Således enkla alternativa metoder som kan kvantifiera HA-och NA-antigen är önskvärda för snabb release och bättre kvalitetskontroll av influensavaccin.
Universellt konserverade regioner i alla tillgängliga influensa A HA-och NA sekvenser identifierades av bioinformatik analyser 6-7. En sekvens (som betecknas som Uni-1) har identifierats i den enda universellt bevaras epitop av HA, fusion peptiden 6, medan två bevarade sekvenser identifierades neuroaminidaser, en nära den enzymatiska aktiva området (som betecknas som HCA-2) och andra nära den N-terminalen (som betecknas som HCA-3) 7. Peptider med dessa aminosyrasekvenser var syntetiseras och användas för att immunisera kaniner för produktion av antikroppar. Antikroppen mot Uni-1 epitopen av HA kunde binda till 13 subtyper av influensa A HA (H1-H13) medan antikroppar mot HCA-2 och HCA-3 regioner i NA var kan binda alla 9 NA-subtyper. Alla antikroppar visade anmärkningsvärd specificitet mot virala sekvenser vilket framgår av iakttagelse att ingen korsreaktivitet mot allantois proteiner upptäcktes. Dessa universella antikroppar används sedan för att utveckla analyser slot blot att kvantifiera HA-och NA i influensa A vaccin utan behov av särskilda antisera 7,8. Vaccin prover appliceras på en PVDF membran med hjälp av en apparat slot blot tillsammans med standardlösningar utspädd till olika koncentrationer. För detektering av HA, togs prover och standard first späds ut i Tris-buffrad saltlösning (TBS) med 4M urea samtidigt för mätning av NA: de var utspädd i TBS som innehåller 0,01% Zwittergent eftersom dessa tillstånd avsevärt förbättrat känslighet. Efter upptäckten av HA-och NA-antigen genom immunoblotting med sina respektive universella antikroppar, var signalen intensiteter kvantifieras av densitometri. Mängder av HA-och NA i vacciner sedan beräknas med hjälp av en standardkurva etablerats med den signal intensiteten hos olika koncentrationer av använda referenser.
Med tanke på att dessa antikroppar binder till universella epitoper i HA eller NA, kan intresserade utredare använda dem som forskningsverktyg i immunoanalyser än facket blot bara.
Protocol
Discussion
Kvantitativ bestämning av influensa virus HA-och NA är kritiska för vaccin forskning och utveckling eftersom dessa två ytproteiner som är viktigast virala komponenter inducera immunsvar 6-11. Tidigare redovisade immunologiska metoder för detektion av dessa proteiner kräver stam specifika antikroppar. Den enkla, reproducerbar och snabb slot blot metod för att kvantifiera HA-och NA-antigen som beskrivs här är lämpliga för alla influensa A virus HA-och NA proteiner eftersom antikropparna känner igen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka fru Monika Tocchi för redaktionell granskning av manuskriptet. AMH stöds av ett stipendium från King Abdulaziz universitet, genom den saudiarabiska kulturella Bureau i Kanada.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
| Bio-Dot SF Filter paper | Bio-Rad | 162-0161 | |
| Immobilon-FL transfer membrane (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
| Vacuum pump | Millipore | WP6111560 | |
| Chemiluminescence BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
| FluorChem Gel Documentation System | Alpha Innotech | 29-008-1896X | |
| Universal rabbit antibodies against HA and NA antigens | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antibodies are available through MTA or can be generated by interested investigators according to the procedures previously described6,7. | |
| Influenza vaccine reference antigen | CBER/FDA or NIBSC | ||
| Influenza vaccine samples | Commonly available in most countries | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | |
| Zwittergent 3-14 Detergent | Calbiochem | 693017 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Blotting Grade Blocker Non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG, (H+L), Peroxidase Conjugated | Thermo Scientific | 31460 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
References
- Webster, R. G., Bean, W. J. Genetics of influenza virus. Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).
- Wood, J. M. The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency. Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).
- Sylte, M. J., Suarez, D. L. Influenza neuraminidase as a vaccine antigen. Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).
- Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection. Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).
- Chun, S. Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins. Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).
- Gravel, C. Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences. Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).
- Li, C. A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide. Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).
- Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1). Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).
- Li, C. Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China. Biologicals. 38, 284-289 (2010).
- Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition. Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).
- Hashem, A. Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus. Biochem Biophys Res Comm. , (2010).
