同系ゼブラフィッシュにおける限界希釈細胞移植を用いた腫瘍増殖細胞の頻度を定量化

Summary

限界希釈細胞移植アッセイは、腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために使用されます。このプロトコルは、蛍光標識された白血病と成人のゼブラフィッシュの腹腔内に限界希釈法でこれらの白血病細胞を分離して移植する方法の詳細を開発する同系のゼブラフィッシュを生成するための方法を説明します。

Abstract

自己複製癌細胞は腫瘍の成長を促進するために無限の能力を有する腫瘍内の唯一の細胞型であり、したがって、腫瘍増殖細胞、または腫瘍開​​始細胞として知られています。それは破壊のためにこれらの自己複製細胞を標的にすることが大幅患者の予後^1を改善、腫瘍の進行を阻止し、再発を停止すると考えられている。腫瘍内で自己複製細胞の頻度を決定する最も一般的な方法は、腫瘍細胞を増加させる用量でレシピエント動物に移植されている限界希釈細胞移植アッセイ、であり、腫瘍を開発し、動物の割合は、数を計算するために使用されます元の腫瘍のサンプル^2、3内自己複製細胞の。理想的には、動物の多数は、正確に腫瘍増殖する細胞の頻度を決定するために、各限界希釈実験に使用されます。しかし、マウスを含む大規模な実験は、高価であり、そしてほとんどの限界希釈アッセイは、実験ごとに10〜15マウスを使用してください。

ゼブラフィッシュは、それらの遺伝子操作の容易さと大規模な実験を実行できるようにするための経済のために大部分は、癌のモデルとして注目を得ています。さらに、ゼブラフィッシュでモデル化されたがんの種類は、密接に、相手の人間の病気^4を模倣することが判明している。それは、レシピエント動物の致死照射して、1つの魚から別の腫瘍細胞を移植することは可能ですが、21日後の免疫システムの再生には、多くの場合、腫瘍の退縮^5を引き起こします。同系ゼブラフィッシュの最近の作成 ​​が大幅に腫瘍移植の研究^6-8を促進^してきた。これらの動物は、遺伝的に同一、移植腫瘍細胞であるため、レシピエントの魚、および腫瘍の成長に確実に生着は、長期間にわたって監視することができます。同系のゼブラフィッシュは、自己再生細胞の周波数^9、10を過小評価することが外国の微小環境で成長、に適応する必要がない腫瘍細胞に希釈移植アッセイを制限するために最適です。また、1セルの移植は成功し自己複製細胞頻度のより正確な見積もりを提供するために役立つ、どちらも同系ゼブラフィッシュ⁸および数百の動物が容易にかつ経済的に一度に移植することができますが、使用して完了しています。

ここで、メソッドは、同系のゼブラフィッシュの主要な、蛍光標識したT細胞急性リンパ芽球性白血病を（T – ALL）の作成、および自己複製細胞の頻度を決定するために、成魚に限界希釈法でこれらの腫瘍を移植するために提示されます。白血病は、例として提供されていますが、このプロトコルは、ゼブラフィッシュのすべてのがんモデルを用いて腫瘍増殖細胞の頻度を決定するために適しています。

Protocol

1。ゼブラフィッシュ胚のDNAのマイクロインジェクション 37℃で一晩NotIで各プラスミドの10μgのを消化することによってGFP 11 DNA構築物：：cMycとRAG2：：RAG2を線形化する 。 フェノール：クロロホルム抽出とは、プラスミドを沈殿させ、そして20μLH 2 Oのそれぞれを再懸濁します。 20μL、10μLと高域のDNAラダーの5μLを1％アガロースゲル上の各消化したプラスミドの1:1、1:5及び1:10希釈を実行することにより、DNAの濃度を決定する。定量化のこのタイプは、一般的に分光器の測定値よりも正確です。 ：cMyc +30ng/μLRAG2：：：GFP CG1 -株（または他の同系株）30ng/μLRAG2を使用して、ゼブラフィッシュ胚に注入するための1MのKCl 0.5 X TEにおける60ng/μLの最終濃度にDNAを希釈する。 注射は、以前に示した12、13として実行する必要があります。簡単に言うと、男性と女性のゼブラフィッシュは、注入前に交尾室で夜を設定されています。注射の日に、DNAが注射針にロードされ、圧力が50μmの直径を持つ気泡がステージのマイクロメータによって測定される、（30pg DNA）追放されるように調整されます。その後、胚は、DNAが細胞に直接注入されると、ではなく卵黄に、1細胞期で注入されています。注入CG1胚および幼虫の生存率は一般に低いと、そして魚のわずか5％は、正常に導入遺伝子を組み込む予定。従って、> 600の胚は、いくつかの魚が白血病を発症することを保証するために注入されるべきである。 28.5 ° Cで注入された胚を保存し、24時間後に死亡胚を削除します。動物は、その後の人生の5日間で大きなタンクに移され、前述したように14を提起している。 2。一次T – ALLゼブラフィッシュ幼生のためのスクリーニング注射後約28日後、ペトリ皿に魚系の水の25mLに4ng / M Tricane – Sの200μLを添加することにより幼虫のゼブラフィッシュを麻酔。 GFP蛍光を（図1）を検出するために20分の485の励起波長と25分の530発光フィルターを使用して、20倍の倍率で落射蛍光顕微鏡を用いてT – ALL蛍光標識の開発のための幼虫を調べます。 負であるものから別の腫瘍正の幼虫。負の幼虫が、後の時点で検査することができます、一度腫瘍はT – ALL正の魚が失われなかったことを保証するために、大きく成長している場合があります。 モニターT – ALL腫瘍の成長を追跡するための落射蛍光顕微鏡を使用して週に最低でも一度に正の魚。 3。蛍光標識一次性白血病細胞の単離および精製 GFP陽性白血病細胞は動物の> 50％を抜いているときに、9mL魚系の水を含むペトリ皿に4ng/mL Tricane – S液1mLを追加することで、魚を生け贄に捧げる。 セルをバッファするために5％ウシ胎児血清を1mLの0.9 PBSを含む新しいペトリ皿に魚を置きます。 、かみそりの刃を持つ魚を痩せ衰えさせるピペット大きな細胞塊を解離するために混合し、50mLのチューブに40μmのメッシュのストレーナを介して細胞を通過する。それは単一の細胞にすべての組織の塊を解離させる必要はありません。 4mlのポリスチレンチューブに細胞のピペット500μL。死んだ細胞をラベルする1μL1mg/mLヨウ化プロピジウム（PI）を、追加。渦は、その後、氷上で細胞を維持する。 、野生型CG1魚を犠牲に柔らかくなると、合計で50mLのチューブに0.9 PBSでtransplant.Add 4mlの5％FBS中に腫瘍細胞の担体として正常な細胞を、収集する上記と同様にひずみ5mLの量。 96ウェルプレートのピペット100μL/wellし、0.9 PBSで5％FBSで正常細胞、希に3 × 10 5細胞/ mLを数える。 以下の用量で血液細胞を含む96ウェルプレートに蛍光活性化細胞ソーター（FACS）、ソートのGFP陽性、PI陰性腫瘍細胞（図2A、B）を使用して：10個/ウェル48ウェル、100細胞/ウェルに24ウェル、/ウェル12ウェル、および10,000細胞/ウェル6ウェルにに1000細胞内へ。さらに、10,000個の細胞が正常な血液細胞なしでウェルにソートされ、再分析はソートされた細胞（図2C）の純度と実行可能性を評価するためにFACSを使用している必要があります。 4。大人のゼブラフィッシュに希釈移植を制限する 10分間2000xgで96ウェルプレートを遠心分離により細胞をペレット化。 上清の95μLを削除し、残りの5μLに細胞を懸濁します。 大人（> 60日齢）同系ゼブラフィッシュ腹側をホールドアップ、および26G / 2"マイクロシリンジを用いて、腹腔内に細胞懸濁液を注入する。ゼブラフィッシュは、移植前に麻酔である必要はありません。通常は、45魚、10白血病細胞を移植され、20は100個の細胞を移植され、7が1,000細胞と5魚を移植され、10,000 T – ALL細胞を移植されています。 5。白血病、開始セルの周波数を決定するために分析移植後約28日後、GFP蛍光を検出するために20分の485の励起波長と25分の530発光フィルターを使用してepifluoresence顕微鏡で移植魚を調べます。注入された魚の合計数あたりの正の魚の数を記録。 最大90日間14日ごとに魚を再検討し、正の魚の数を記録。腫瘍陽性魚が瀕死になると、Tricane – S過剰投与によって動物を生け贄に捧げる。 図3Dに示すように、テーブルにその結果、入力。 Webベースのエルダ（エクストリーム限界希釈法）における統計ソフトウェアにデータをアップロードhttp://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.htmlで腫瘍の正と負の動物の周波数を使用する15一次T – ALLの中で白血病細胞が自己複製の頻度を決定するために、各移植の用量。 6。代表的な結果： 同系の魚から胚へのDNAのマイクロインジェクションは、多くの場合、胚の<60％が24時間生存して、注入胚の低い生存率をもたらす。さらに、注入された同系の魚の生存率は、しばしば<20％が28日間の存続と、一般的に幼虫の開発中に悪いです。 T – ALL発症するトランスジェニックフィッシュを作成するために胚を大量に注入することが重要です。 例として、CG1ひずみ胚はRAG2を注入した：：cMyc + RAG2：：GFP。導入遺伝子は、GFPを発現するすべてのセルにもcMyc表現されるように、胚に共分離する。幼虫は、T – ALL 28日（図1）の後に一次スクリーニングを行った。前の仕事は、注入された魚の約5％が胸腺内T細胞（図1）GFP陽性、及びT -細胞が11を形質転換さとしてこれらの魚の100％が白血病を発症する。与えることが示されているゼブラフィッシュの小さな割合は、28日目で検出するのは非常に簡単です、より高度な白血病を持っているかもしれないが、ほとんどは、GFP陽性の胸腺（図1）を持っているので、幼虫はそのすべての正の確保するために高倍率下で個々に検討する必要があります魚が選択されています。 GFP陽性T – ALL細胞は日45から70の間に動物の> 50％を追い越すだろう。 提供される例では、ゼブラフィッシュは、人生の65日で屠殺し、白血病細胞を単離し、FACSで希釈移植を制限するために選別した。ヨウ化プロピジウム陰性と（図2）のGFP陽性単一細胞を96ウェルプレートに分類された。再解析は実行可能性（理想的には> 95％）と純度を評価するために10,000ソートされた細胞で行われていた（理想的には> 92％、図2）。移植T -オールズは一般的に28日間前に発生するが、一部の腫瘍は開発するために60日以上かかる場合があります。いくつかのT -オールズがより進んでいたが、この例では、28日目で、初期段階の腫瘍は腹膜腔（図3C）を埋めるために拡大した、、注射部位の近くにGFP陽性細胞（図3B）の領域と見られ。 T -オールズつの異なるプライマリから希釈細胞移植アッセイの制限からのデータは、図3Dに示されています。これらの実験のために、220頭以上の動物は簡単に数時間内に一人で達成することができる、移植した。エルダのソフトウェアを使用してデータ分析は平均で、135の1はT – ALL細胞は白血病増殖型の細胞（図3E）自己複製された、ことを示した。 図1 ぼろと1細胞期に注入ゼブラフィッシュの幼虫：。：- cMyc +ぼろ：：- EGFPは、一次性白血病の成長のためにスクリーニングした28日後に注射。魚は（*）胸腺内T細胞のGFP陽性だった; T -細胞が時間をかけて、変換になるとこの魚は、T – ALLを開発します。この段階では、28日目で非常に一般的です。一つの魚は（**）高度なT – ALLの軟組織に拡がっていることがありました。残りの二匹の魚は、腫瘍の成長のために否定的です。画像は16Xの倍率で撮影された。 図2蛍光標識したT – ALL細胞は病気の動物からソートし、限界希釈細胞移植アッセイで使用されていた。最初に、ゲートが単一のセルを（左上のパネル）を選択して描画されて、その後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞（中央左のパネル）が選択されています。最後に、ゲートは（左下のパネル）のソートのためにのみGFP陽性白血病細胞を選択するために描かれました。ソートされた細胞は、移植（右パネル）の前に実行可能性と純度を評価するために再解析する必要があります。 図3。ゼブラフィッシュは28日、移植後の白血病の成長を調べた。魚は、NEG腫瘍です。ativeは（）、注射部位（B）で成長して小さな腫瘍を持っている、または進行した白血病（C）を持っている。画像は7X倍率で撮影したもの。各希釈で移植魚の総数あたり白血病陽性魚の総数は、（D）のように、記録されます。データは自己再生白血病細胞と上側と下側95％信頼区間（E）の数を計算するためにWebベースのエルダのプログラムに入力される。

Discussion

がん研究にゼブラフィッシュを用いての主な強みは、動物の多数は、比較的低コストで使用できることです。これは移植総数に腫瘍を開発、移植動物の割合は腫瘍開始細胞の頻度を決定するために使用される希釈細胞移植アッセイを、制限することで特に重要です。ここで紹介した方法では、70以上の移植のレシピエント動物が腫瘍増殖細胞数の正確な推定値を提供する、アッセイごとに使用されています。使用する動物の数と移植腫瘍細胞の投与量の両方が与え癌モデル用に最適化されるべきである、例えば、初期の実験では腫瘍開始細胞はまれである示している場合、有用な移植の投与量は100,000、50,000、10,000と1,000の細胞かもしれない移植。

同系のゼブラフィッシュの株は希釈分析を制限するのに有用である。しかし、これらの株はまだ一般的に、すべてのラボで使用されていない、といくつかのゼブラフィッシュ癌モデルは、同種の魚にのみ存在します。自己複製細胞頻度が同系のゼブラフィッシュは^8を使用した場合よりも10〜100倍高いとして計算されることがありますが、限界希釈細胞移植は、免疫アブレーションを受けた野生型株で行うことができます。いくつかの腫瘍細胞は、外国の微小環境に移植には耐えられないので、細胞の大きな用量は、非免疫整合、照射された受信者への移植のために使用されるべきであることに注意することは重要です。さらに、多くの腫瘍は、レシピエント動物の免疫系が回復2​​1日後に退縮し始めるので、動物は7日毎に移植後の腫瘍の成長のために評価すべきである。

ここで紹介する方法は任意のゼブラフィッシュ癌モデルでの使用に適しており、これまでT細胞急性リンパ芽球性白血病^8、および固形腫瘍モデル、横紋筋肉腫^16の両方で、セルの周波数を腫瘍開始を決定するために使用されています。これらの腫瘍は、蛍光癌遺伝子と蛍光マーカーの両方を持つ胚の同時注入によって標識した、DNA共偏析するため、癌遺伝子を発現している任意のセルには、蛍光タンパク質^17を発現するであろう。それは動物を犠牲にすることなく腫瘍の増殖の追跡を容易にし、FACSによって腫瘍細胞を単離するために直接的な方法を提供するため、蛍光が推奨されますが、それは彼らの精製を容易にするための腫瘍特異メーカーに対する抗体で、腫瘍細胞を標識することが可能です。 、ゼブラフィッシュにおいても抗体の染色は、最適化が必要な場合があります。

最後に、一度腫瘍増殖細胞の発生率が特定の腫瘍タイプに対して決定された、それらの細胞の頻度を支配するメカニズムを識別するために、これらのアッセイを使用することが可能です。例えば、原発腫瘍の細胞は、希釈の移植、または移植された魚を制限する前に経路特異的阻害剤で治療することができます自体が薬物を投与することができます。さらに、腫瘍自体の遺伝学は、その結果、原発腫瘍の遺伝子を過剰発現するように、目的の遺伝子を一細胞期の魚を注入することによって操作され得る。これらの実験では、自己複製細胞の頻度には影響は限界希釈アッセイで観察される。

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number
NotI restriction enzyme	New England Biolabs	R0189
Phenol:Chloroform	EMD Biochemicals	6805-OP
5M KCl	Sigma-Aldrich	P9541
100X Tris-EDTA	Sigma-Aldrich	T9285
High Range DNA ladder	Fermentas	R0621
Syngeneic zebrafish		References6-8
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000-036
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4864
26G/2″ Microsyringe	Hamilton	80366
40μm mesh cell strainer	BD Falcon	352340