Sınırlandırılması seyreltme hücre nakli deneyleri, tümör yayılan hücrelerinin sıklığını belirlemek için kullanılır. Bu protokol, floresan etiketli lösemi ve yetişkin zebrafish periton boşluğuna seyreltme sınırlayan bu lösemi hücreleri izole etmek ve nakli nasıl detayları gelişen singeneik Zebra balığı üretmek için bir yöntem açıklanır.
Kendini sürekli yenileyen kanser hücrelerinin tümör büyümesini teşvik etmek için sınırsız bir yeteneğe sahip bir tümör içinde tek hücre tipleri, ve böylece yayılan tümör hücreleri veya tümör başlatan hücreleri olarak bilinir. Bu, hastanın prognozu 1 büyük ölçüde geliştirerek, bu yıkımı için kendini sürekli yenileyen hücreleri hedef tümörün ilerlemesini engellemek ve nüks durdurmak olacağı düşünülmektedir. Sıklığını belirlemek için en yaygın yolu kendi kendini yenileyen bir tümör hücreleri içinde artan dozlarda alıcı hayvanlar tümör hücreleri nakledilen bir sınırlayıcı seyreltme hücre nakli testi tümörler gelişir hayvanların oranı sayısını hesaplamak kullanılır kendi kendini yenileyen hücreler içinde orijinal tümör örneği, 2, 3 . İdeal olarak, çok sayıda hayvan doğru yayılan tümör hücreleri, sıklığını belirlemek için her sınırlayıcı seyreltme deneyde kullanılacak. Ancak, büyük ölçekli deneyler fareler içeren pahalı ve en sınırlayıcı seyreltme testleri Deneme başına sadece 10-15 fareler kullanır.
Zebra balığı, genetik manipülasyon ve büyük ölçekli deneyler yapılabilir hangi ekonomi kendi kolaylığı nedeniyle büyük bir kısmı, bir kanser model olarak önem kazanmıştır. Ayrıca, zebrafish modellenir kanser türleri kendi meslektaşı insan hastalığı 4 yakından taklit olduğu tespit edilmiştir. Alıcı hayvanların alt öldürücü ışınlama, 21 gün sonra bağışıklık sisteminin yenilenme başka bir balık tümör hücrelerinin nakli için mümkün olsa da genellikle tümör regresyonu 5 neden olur. Singeneik zebrafish son yaratılması tümör nakli çalışmaları büyük ölçüde 6-8 kolaylaştırmıştır . Bu hayvanlar sağlam alıcı balık, ve tümör büyüme içine genetik olarak aynı, nakledilen tümör hücreleri aşılamak olduğundan uzun süre üzerinden takip edilebilir. Singenik zebrafish, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı 9, 10 hafife bir yabancı mikroçevresinin büyüme, uyum sağlamak zorunda değilsiniz, bu tümör hücrelerinin seyreltme nakli deneyleri sınırlandırmak için idealdir. Ayrıca, tek hücre nakli başarıyla kendini sürekli yenileyen hücre sıklığı daha doğru bir tahmin sağlamak için hizmet, her ikisi de, kolay ve ekonomik bir kerede transplante edilebilir singeneik zebrafish 8 ve birkaç yüz hayvanlar, kullanarak tamamlanmıştır .
Burada singeneik zebrafish ilköğretim floresan etiketli T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) oluşturma ve kendini sürekli yenileyen hücre sıklığını belirlemek için bu tümörler erişkin balık seyreltme sınırlayıcı nakli için bir yöntem sunulmuştur. Lösemi bir örnek olarak verilmiştir iken, bu protokolü, zebrafish herhangi bir kanser modeli kullanılarak yayılan tümör hücreleri sıklığını belirlemek için uygundur.
Kanser araştırma zebrafish kullanarak büyük bir gücü nispeten düşük maliyetle çok sayıda hayvan kullanılabilir olması. Bu nakledilen toplam sayısı tümörler gelişir nakledilen hayvanların oranlarda tümör başlatan hücre frekansı belirlemek için kullanılan seyreltme hücre nakli deneyleri, sınırlayıcı özellikle önemlidir. Burada sunulan yöntem, 70'in üzerinde transplant hayvanlar yayılan tümör hücre sayısının doğru bir tahmin, analiz başına kullanılır. Faydalı nakli dozlarda kullanılan hayvanların sayısı ve tümör hücreleri nakledilen dozu her ikisi de belli bir kanser model için optimize edilmiş olmalıdır, örneğin, ilk deneylerde, tümör başlatılması hücreler nadirdir gösterirseniz, 100.000, 50.000, 10.000 ve kişi başına 1.000 hücreleri olabilir nakli.
Singenik zebrafish suşları seyreltme analizi sınırlamada yararlı. Ancak, bu suşların henüz yaygın olarak tüm laboratuarlarda kullanılan ve bazı zebrafish kanser modelleri sadece allojenik balık mevcut değildir. Kendini sürekli yenileyen hücre frekans singenik zebrafish 8 kullanılmış olsaydı göre 10-100 kat daha yüksek olarak hesaplanmıştır olabilir, ancak sınırlandırılması seyreltme hücre transplantasyonu, bağışıklık ablasyon geçiren vahşi-tip suşlar yapılabilir . Bazı tümör hücreleri yabancı bir mikroçevresinin nakli hayatta olmaz gibi, hücrelerin daha yüksek dozlarda non-immün eşlemeli, ışınlanmış alıcıların içine nakli için kullanılması gerektiğini not etmek önemlidir. Ayrıca, alıcı hayvanın bağışıklık sistemi kurtarır 21 gün sonra birçok tümörde gerileme başlayacak, bu yüzden hayvanların her 7 gün nakli sonrası tümör büyüme için değerlendirilmelidir.
Burada sunulan yöntemler herhangi bir zebrafish kanser modeli ile kullanım için uygundur ve şimdiye kadar belirlemek için kullanılır olmuştur tümör başlatılması T-hücreli akut lenfoblastik lösemi 8, ve solid tümör modeli, rabdomyosarkom 16 hücre frekansı . Bu tümörler floresan bir onkogen ve floresan işaretleyici hem de embriyo ko-enjeksiyon etiketli; DNA co-ayıran, onkogen ifade herhangi bir hücreyi, floresan proteini 17 ifade çünkü . Hayvan kurban etmek gerek kalmadan tümör büyümesini izleme kolaylaştırır ve FACS tümör hücreleri izole etmek için ileri düz bir yol sağlar çünkü floresan tavsiye edilir iken, kendi arıtma kolaylaştırmak için, tümör spesifik vericiler antikorlar ile tümör hücrelerinin etiket mümkün zebrafish da olsa antikor boyama optimizasyon gerekebilir.
Son olarak, bir kez, tümör yayılan hücrelerinin sıklığı belirli bir tümör türü için tespit edilmiştir, bu testlerin kendi cep frekansını yöneten mekanizmaları tanımlamak için kullanmak mümkündür. Örneğin, seyreltme nakli ya da kendilerini uyuşturucu ile dozajlanarak olabilir nakledilen balık sınırlayan önce primer tümör hücrelerinin yolağı spesifik inhibitörleri ile tedavi edilebilir. Ayrıca, tümörler kendilerini genetiği sonucunda primer tümör gen-express böylece, tek hücreli bir sahne balık ilgi bir gen enjekte ederek manipüle olabilir. Bu deneylerde, kendini sürekli yenileyen hücre frekansı üzerinde herhangi bir etkisi sınırlayıcı seyreltme testleri görülecektir.
The authors have nothing to disclose.
Finansman NIH hibe 5T32CA09216-26 (JSB için), ve K01 AR055619-01A1 ve 3 K01 AR055619-03S1 (DML için), yanı sıra Alex'in Limonata Standı Vakfı tarafından, Harvard Kök Hücre Enstitüsü ve Amerikan Kanser tarafından sağlanan edilmiştir vardır Toplum.
Name of the Reagent | Company | Catalog Number |
---|---|---|
NotI restriction enzyme | New England Biolabs | R0189 |
Phenol:Chloroform | EMD Biochemicals | 6805-OP |
5M KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
100X Tris-EDTA | Sigma-Aldrich | T9285 |
High Range DNA ladder | Fermentas | R0621 |
Syngeneic zebrafish | References6-8 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-036 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
26G/2″ Microsyringe | Hamilton | 80366 |
40μm mesh cell strainer | BD Falcon | 352340 |