पूरे माउंट<em> स्वस्थानी में</em> E8.5 E11.5 माउस भ्रूण संकरण
Summary
इस पूरे माउंट<em> स्वस्थानी में</em> संकरण प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण कदम है कि E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जीन की अभिव्यक्ति अध्ययन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को सुनिश्चित करने के बारे में चर्चा है.
Abstract
स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को परिभाषित करने के लिए एक बहुत जानकारीपूर्ण दृष्टिकोण है. स्वस्थानी संकरण प्रक्रिया में लंबा है और तकनीकी रूप से कई महत्वपूर्ण कदम है कि सामूहिक रूप से अंतिम परिणाम की गुणवत्ता के लिए योगदान के साथ की मांग की. यह प्रोटोकॉल का विस्तार कई जांच लेबलिंग और प्रदर्शन के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण कदम वर्णन में कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है महत्वपूर्ण आवश्यक कदम की reproducibly उच्च गुणवत्ता परिणाम प्राप्त करने के लिए. सबसे पहले, हम digoxygenin (डीआईजी) लेबल डीएनए पीसीआर द्वारा उत्पन्न टेम्पलेट्स विट्रो प्रतिलेखन में शाही सेना के माध्यम से जांच की पीढ़ी का वर्णन करता है. हम तीन महत्वपूर्ण assays गुणवत्ता नियंत्रण का वर्णन करने के लिए राशि, अखंडता और जांच डीआईजी लेबल की विशिष्ट गतिविधि का निर्धारण. ये कदम पर्याप्त संवेदनशीलता की एक जांच पैदा करने के लिए एक पूरी माउस भ्रूण में अंतर्जात mRNAs का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं.इसके अलावा, हम निर्धारण और स्वस्थानी संकरण में E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण की भंडारण के लिए विधियों का वर्णन. तो, हम rehydrated संकरण की स्थिति के बाद संकरण washes और RNase गैर विशिष्ट जांच संकरण को हटाने के लिए इलाज के विवरण के बाद भ्रूण की सीमित proteinase कश्मीर पाचन के लिए विस्तृत विधियों का वर्णन. एक एंटीबॉडी एपी संयुग्मित लेबल जांच कल्पना और अंतर्जात प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति पैटर्न प्रकट करने के लिए किया जाता है. प्रतिनिधि परिणाम सफल प्रयोगों और ठेठ suboptimal प्रयोगों से दिखाए जाते हैं.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों के विभिन्न स्रोतों के एक नंबर से अनुकूलित किया गया है और पूरे माउंट E8.5 E11.5 दिन पुराने माउस भ्रूण के लिए अनुकूलित. हड्डीवाला भ्रूण की स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH अनुदान R21MH082360 (BGC) और R01HD056315 (एनआरएम) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जॉर्जिया के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
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