전체 산<em> 현장에서</emE11.5 마우스 태아에 E8.5의> 하이브리드
Summary
이 모든 마운트<em> 현장에서</em> 하이브리드 프로토콜은 E8.5 – E11.5 일 이전 마우스 배아의 유전자 발현 연구에 대한 재현 고품질의 결과를 보장 중요한 단계를 설명합니다.
Abstract
현장 하이브리드 화의 전체 마운트는 배아의 유전자 발현 패턴을 형성하기위한 매우 유익한 방법이다. 현장 하이브리드 절차에는 긴 있으며, 기술적으로 통칭 최종 결과의 질에 기여하는 여러 중요한 단계를 요구.이 프로토콜은 프로브 레이블과 성능을 최적화하기위한 세부 몇 가지 주요 품질 관리 단계에 대해 설명합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다 필요한 중요한 단계 중 reproducibly 고품질의 결과를 얻을 수 있습니다. 첫째, 우리는 PCR에 의해 생성 된 DNA 템플릿의 체외 스크립트의를 통해 digoxygenin (파)이라는 RNA 프로브의 생성을 설명합니다. 우리는 양, 무결성 및 파 – 라벨 프로브의 특정 활동을 결정하는 세 가지 중요한 품질 관리 assays을 설명합니다. 이 단계는 전체 마우스 배아에서 내생 mRNAs를 감지하기에 충분한 감도의 프로브를 생성하기 위해 중요합니다.또한, 우리는 현장 하이브리드 화에 대한 E8.5 – E11.5 일 이전 마우스 배아의 고정 및 저장하는 방법을 설명합니다. 그런 다음, 우리는 하이브리드 조건, 사후 하이브리드 세차 및 비 특정 프로브 하이브 리다이 제이션을 제거하는 RNase 처리의 세부 정보가 rehydrated 배아의 제한 proteinase K는 소화에 대한 자세한 방법을 설명합니다. AP-복합 항체가 표시 프로브를 시각화하고 내생 성적표의 표현 패턴을 표시하는 데 사용됩니다. 대표 결과는 성공적인 실험과 일반 차선 실험에서 표시됩니다.
Protocol
1. 체외 스크립트에 통해 Riboprobe 생성 체외 스크립트 템플릿에 대한 PCR 제품을 준비합니다. 자신의 5 '끝에서 파지의 전사 프로모터 시퀀스와 디자인 PCR의 프리 머. 참고 : 발기인 순서는 의미 – 스트랜드 PCR 프라이머의 5'end하는 의미 프로브를 인식에 사용됩니다 추가하고 발기인 순서는 안티센스 PCR 프라이머의 5'end에 추가는 안티 – 감지 프?…
Discussion
이 프로토콜에 설명 된 방법은 다른 소스들로부터 적응 및 전체 마운트 E8.5 – E11.5 일 이전 마우스 배아에 최적화되어 있습니다. 척추 동물의 배아의 현장 하이브리드 화에 전체 마운트하기위한 방법은 먼저 1990 년대 초 2,5-12에 나타났다. 이 프로토콜은 주로 Xenopus의 배아 7,8뿐만 아니라 마우스 2,11 용으로 개발 된 방법에서 적응되었습니다. 우리 프로토콜에서…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 보조금 R21MH082360 (BGC)와 R01HD056315 (NRM)뿐만 아니라 조지아 대학에서 지원했다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
References
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Whole MountIn Situ HybridizationGene Expression PatternsEmbryosProbe LabelingQuality ControlDIG-labeled RNA ProbesIn Vitro TranscriptionPCRSensitivityEndogenous MRNAFixationStorageProteinase K DigestionHybridization ConditionsPost-hybridization WashesRNase TreatmentNon-specific Probe HybridizationAP-conjugated Antibody
Cite This Article
Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (56), e2797, doi:10.3791/2797 (2011).