Tutto il monte In Situ di E8.5 a E11.5 embrioni di topo
Summary
Questo monte tutto<em> In situ</emIbridazione> protocollo discute passaggi critici che assicurano riproducibile risultati di alta qualità per gli studi di espressione genica in E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita.
Abstract
Montare tutto ibridazione in situ è un approccio molto informativo per la definizione di schemi di espressione genica negli embrioni. Le procedure di ibridazione in situ sono lunghi e tecnicamente impegnativo, con passi più importanti che insieme contribuiscono alla qualità del risultato finale. Questo protocollo descrive in dettaglio alcuni punti chiave del controllo della qualità per l'etichettatura sonda l'ottimizzazione e le prestazioni. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei passi fondamentali necessari per ottenere risultati di alta qualità riproducibile. In primo luogo, si descrive la generazione di digossigenina (DIG) sonde marcate nella trascrizione dell'RNA tramite modelli in vitro di DNA generati mediante PCR. Ci descrivono tre saggi critici di controllo di qualità per determinare la quantità, l'integrità e l'attività specifica del DIG-sonde marcate. Questi passaggi sono importanti per la generazione di una sonda di sensibilità sufficiente per rilevare mRNA endogeni in un embrione di topo intero. Inoltre, si descrivono i metodi per la fissazione e lo stoccaggio di E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita per l'ibridazione in situ. Poi, si descrive metodi dettagliati di limitata digestione proteinasi K degli embrioni reidratati seguita da i dettagli delle condizioni di ibridazione, di post-ibridazione lavaggi e trattamenti per eliminare RNAsi non specifici ibridazione sonda. AP-coniugato anticorpale è utilizzato per visualizzare le sonda marcata e rivelare il pattern di espressione del trascritto endogena. Risultati rappresentativi sono riportati da esperimenti di successo e tipici esperimenti non ottimale.
Protocol
Discussion
I metodi descritti in questo protocollo sono stati adattati da un certo numero di fonti diverse e ottimizzato per montare tutto E8.5-E11.5 embrioni di topo giorno di vita. Metodi per montare tutto ibridazione in situ degli embrioni dei vertebrati prima apparizione nei primi anni 1990 2,5-12. Questo protocollo è stato adattato principalmente dai metodi sviluppati per gli embrioni di Xenopus 7,8 e 2,11 del mouse. Nel nostro protocollo una grande enfasi è posta sulla valutazione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede R21MH082360 (Cgcf) e R01HD056315 (NRM), così come l'Università della Georgia.
Materials
| Name | Type | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
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