Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders
Summary
Cultuur van normale cellen in hun drie-dimensionale context is een alternatieve methode voor vroege gebeurtenissen die nodig is voor cellulaire transformatie en tumorvorming te bestuderen. Deze methode wordt gebruikt om de normale eierstokken en oviductal cellen groeien naar vroege gebeurtenissen bij eierstokkanker vorming te bestuderen.
Abstract
Eierstokkanker is de vijfde belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen en heeft een 63% sterfte in de Verenigde Staten 1. Het celtype van oorsprong voor eierstokkanker is nog steeds in vraag en kunnen zowel ovariële oppervlakte-epitheel (OSE) of het distale epitheel van de eileider fimbriae 2,3. Het kweken van de normale cellen als een primaire cultuur in vitro in staat zal stellen wetenschappers om specifieke wijzigingen die zouden kunnen leiden tot kanker van de eierstokken in de verschillende epitheel, waardoor definitief het celtype van herkomst bepalen model. Dit zal toelaten de ontwikkeling van meer accurate biomarkers, diermodellen met weefsel-specifieke genetische veranderingen, en de beste preventiestrategieën gericht op deze ziekte.
Behoud van normale cellen in alginaat hydrogelen bevordert de korte termijn in vitro cultuur van cellen in hun drie-dimensionale context en maakt de invoering van plasmide DNA, siRNA, en kleine moleculen. Door het kweken van organen in stukken die zijn afgeleid van de strategische snijdt met behulp van een scalpel, verschillende culturen uit een enkel orgaan kan worden gegenereerd, waardoor het aantal experimenten uit een enkel dier. Deze besparingen model aspecten van de ovulatie leidt tot verspreiding van het OSE, die wordt geassocieerd met eierstokkanker formatie. Celtypen, zoals de OSE die niet goed groeien op plastic oppervlakken kunnen worden gekweekt met behulp van deze methode en te vergemakkelijken onderzoek naar de normale cellulaire processen of de vroegste gebeurtenissen in de vorming van kanker 4.
Alginaat hydrogelen kan worden gebruikt om de groei van vele soorten weefsels 5 ondersteunen. Alginaat is een lineaire polysaccharide bestaat uit repeterende eenheden van β-D-mannuronic zuur en α-L-guluronzuur die kunnen worden verknoopt met calcium-ionen, resulterend in een zachte geleermiddelen actie die geen schade weefsels 6,7. Net als andere drie-dimensionale celcultuur matrices, zoals Matrigel, alginaat biedt mechanische ondersteuning voor weefsels, maar eiwitten zijn niet reactief met het alginaat matrix, en dus alginaat functioneert als een synthetisch extracellulaire matrix die niet starten cell signaling 5. Het alginaat hydrogel drijft in de standaard celcultuurmedium en ondersteunt de architectuur van het weefsel groei in vitro.
Een methode wordt voorgesteld voor de voorbereiding, scheiding, en inbedding van eierstok-en oviductal orgel stukken in alginaat hydrogels, die in cultuur worden gehouden voor maximaal twee weken. De enzymatische release van cellen voor de analyse van eiwitten en RNA monsters van de orgelcultuur wordt ook beschreven. Ten slotte is de groei van de primaire celtypen is mogelijk zonder genetische immortalisatie van muizen en vergunningen onderzoekers om knockout en transgene muizen te gebruiken.
Protocol
Discussion
De ontwikkeling van een driedimensionaal orgelcultuur systeem gebruik te maken van alginaat hydrogelen is een veelzijdige methode voor het analyseren van verschillende soorten weefsel uit een grote verscheidenheid van organismen. Het gebruik van 3D culturen kan worden uitgebreid tot het gebied van tissue engineering en regeneratieve geneeskunde omdat het een steiger waarop cellen kunnen groeien 11. Momenteel is ons laboratorium die een initiële onderzoek met humane ovarium en eileiders weefsel, maar de cultu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Ovarian Cancer Research Fund [subsidie LT/UIC/01.2011], de UIC Centrum voor klinisch en translationeel Science, de UIC Cancer Center, en de National Institutes of Health te verlenen C06RR15482.
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door AAALAC ingesteld op grond van goedgekeurde dieren zorgprotocollen door de Animal Care en gebruik Comite op UIC. Dieren voor dit project zijn ondergebracht op het vlak van kamers in de biologische rijkdommen Laboratory (BRL) aan de Universiteit van Illinois in Chicago. De BRL heeft een volledig diergeneeskundig personeel dat dieren controleert minstens tweemaal per dag en geeft advies over de verzorging van dieren.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leibovitz L-15 medium | Gibco | 11415 | |
| αMEM medium | Gibco | 12000-022 | |
| Sodium alginate | Novamatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster Carr | 45″ wide roll; 0.0041″ opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | Gibco | |
| ITS solution | Roche | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Labs | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin. 59, 225-249 (2009).
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as biomaterials. Macromol Biosci. 6, 623-633 (2006).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , .
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C. Gonadotropins and ovarian cancer. Endocr Rev. 28, 440-461 (2007).
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation–a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
