Los hidrogeles de alginato para la cultura del órgano en tres dimensiones de los ovarios y oviductos
Summary
Cultivo de células normales en sus tres dimensiones contexto representa un método alternativo para estudiar los primeros eventos necesarios para la transformación celular y tumorigénesis. Este método se utiliza para producir los ovarios normales y las células del oviducto para estudiar los eventos tempranos en la formación de cáncer de ovario.
Abstract
El cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres y tiene una tasa de mortalidad del 63% en los Estados Unidos 1. El tipo de célula de origen de los cánceres de ovario sigue siendo en cuestión y podría ser el epitelio superficial del ovario (OSE) y del epitelio distal de la trompa de Falopio fimbrias 2,3. El cultivo de las células normales como cultivo primario in vitro permitirá a los científicos para modelar los cambios específicos que podrían conducir al cáncer de ovario en el epitelio distintas, lo que definitivamente la determinación del tipo de célula de origen. Esto permitirá el desarrollo de marcadores biológicos más precisos, los modelos animales con cambios en los tejidos específicos de genes, y mejores estrategias de prevención dirigidas a esta enfermedad.
El mantenimiento de las células normales en los hidrogeles de alginato promueve a corto plazo en el cultivo in vitro de las células en sus tres dimensiones contexto y permite la introducción de ADN plásmido, siRNA, y moléculas pequeñas. Por los órganos de cultivo en las piezas que se derivan de los cortes estratégicos utilizando un bisturí culturas, varios de un solo órgano se pueden generar, aumentar el número de experimentos de un solo animal. Estos recortes aspectos el modelo de la ovulación que conduce a la proliferación de la OSE, que se asocia con la formación de cáncer de ovario. Tipos de células, como el entorno de sistema operativo que no crecen bien en superficies de plástico pueden ser cultivadas con este método y facilitar la investigación sobre los procesos celulares normales o los primeros eventos en la formación del cáncer 4.
Hidrogeles de alginato se pueden utilizar para apoyar el crecimiento de muchos tipos de tejidos 5. El alginato es un polisacárido lineal compuesto por unidades repetidas de β-D-manurónico ácido y α-L-gulurónico ácido que puede ser reticulado con iones de calcio, lo que resulta en una acción gelificante suave que no dañan los tejidos 6,7. Al igual que otras matrices tridimensionales de cultivo celular como Matrigel, alginato proporciona soporte mecánico para los tejidos, sin embargo, las proteínas no son reactivos con la matriz de alginato, y por eso funciona como una matriz de alginato de síntesis extracelular que no inicia la señalización celular 5. El hidrogel de alginato flota en el medio de cultivo celular estándar y compatible con la arquitectura del crecimiento de los tejidos in vitro.
Se presenta un método para la preparación, la separación, y la inclusión de ovario y el oviducto pedazos de órganos en los hidrogeles de alginato, que pueden mantenerse en cultivo durante un máximo de dos semanas. La liberación enzimática de las células para el análisis de proteínas y RNA de muestras de la cultura de órganos también se describe. Finalmente, el crecimiento de tipos de células primarias es posible sin la inmortalización genética de ratones y permite a los investigadores a utilizar por nocaut y en ratones transgénicos.
Protocol
Discussion
El desarrollo de un sistema de órganos en tres dimensiones utilizando los hidrogeles de alginato de la cultura representa un método versátil para el análisis de muchos tipos diferentes de tejidos a partir de una amplia variedad de organismos. El uso de cultivos en 3D se puede extender a los campos de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, ya que proporciona un andamio en el que las células pueden crecer 11. En la actualidad, nuestro laboratorio está pasando por los estudios iniciales con los…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación del Cáncer de ovario [conceder LT/UIC/01.2011], el Centro para la Ciencia UIC clínica y traslacional, el Centro de Cáncer de la UIC, y los Institutos Nacionales de Salud de subvención C06RR15482.
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por AAALAC en los protocolos aprobados por el cuidado de animales por el Cuidado de Animales y el empleo en la UIC. Los animales de este proyecto se encuentran en las salas de barrera en el Laboratorio de Biología de Recursos (BRL) de la Universidad de Illinois en Chicago. El BRL cuenta con un personal totalmente veterinario que supervisa los animales por lo menos dos veces al día y ofrece asesoramiento sobre cuidado de los animales.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leibovitz L-15 medium | Gibco | 11415 | |
| αMEM medium | Gibco | 12000-022 | |
| Sodium alginate | Novamatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster Carr | 45″ wide roll; 0.0041″ opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | Gibco | |
| ITS solution | Roche | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Labs | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
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