Los hidrogeles de alginato para la cultura del órgano en tres dimensiones de los ovarios y oviductos

Resumen

Cultivo de células normales en sus tres dimensiones contexto representa un método alternativo para estudiar los primeros eventos necesarios para la transformación celular y tumorigénesis. Este método se utiliza para producir los ovarios normales y las células del oviducto para estudiar los eventos tempranos en la formación de cáncer de ovario.

Resumen

El cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres y tiene una tasa de mortalidad del 63% en los Estados Unidos ^1. El tipo de célula de origen de los cánceres de ovario sigue siendo en cuestión y podría ser el epitelio superficial del ovario (OSE) y del epitelio distal de la trompa de Falopio fimbrias ^2,3. El cultivo de las células normales como cultivo primario in vitro permitirá a los científicos para modelar los cambios específicos que podrían conducir al cáncer de ovario en el epitelio distintas, lo que definitivamente la determinación del tipo de célula de origen. Esto permitirá el desarrollo de marcadores biológicos más precisos, los modelos animales con cambios en los tejidos específicos de genes, y mejores estrategias de prevención dirigidas a esta enfermedad.

El mantenimiento de las células normales en los hidrogeles de alginato promueve a corto plazo en el cultivo in vitro de las células en sus tres dimensiones contexto y permite la introducción de ADN plásmido, siRNA, y moléculas pequeñas. Por los órganos de cultivo en las piezas que se derivan de los cortes estratégicos utilizando un bisturí culturas, varios de un solo órgano se pueden generar, aumentar el número de experimentos de un solo animal. Estos recortes aspectos el modelo de la ovulación que conduce a la proliferación de la OSE, que se asocia con la formación de cáncer de ovario. Tipos de células, como el entorno de sistema operativo que no crecen bien en superficies de plástico pueden ser cultivadas con este método y facilitar la investigación sobre los procesos celulares normales o los primeros eventos en la formación del cáncer ^4.

Hidrogeles de alginato se pueden utilizar para apoyar el crecimiento de muchos tipos de tejidos ^5. El alginato es un polisacárido lineal compuesto por unidades repetidas de β-D-manurónico ácido y α-L-gulurónico ácido que puede ser reticulado con iones de calcio, lo que resulta en una acción gelificante suave que no dañan los tejidos ^6,7. Al igual que otras matrices tridimensionales de cultivo celular como Matrigel, alginato proporciona soporte mecánico para los tejidos, sin embargo, las proteínas no son reactivos con la matriz de alginato, y por eso funciona como una matriz de alginato de síntesis extracelular que no inicia la señalización celular ^5. El hidrogel de alginato flota en el medio de cultivo celular estándar y compatible con la arquitectura del crecimiento de los tejidos in vitro.

Se presenta un método para la preparación, la separación, y la inclusión de ovario y el oviducto pedazos de órganos en los hidrogeles de alginato, que pueden mantenerse en cultivo durante un máximo de dos semanas. La liberación enzimática de las células para el análisis de proteínas y RNA de muestras de la cultura de órganos también se describe. Finalmente, el crecimiento de tipos de células primarias es posible sin la inmortalización genética de ratones y permite a los investigadores a utilizar por nocaut y en ratones transgénicos.

Protocolo

1. La disección de ovario y el aislamiento de los tejidos

1. Prepare una solución al 0,5% (w / v) de alginato de sodio, de preparar una versión modificada del protocolo descrito previamente ^5, con PBS estéril y calentar a 37 º C. Mezclar por inversión o de rock, pero no del vórtice. Dibujar el alginato en una jeringuilla de 1 ml con una aguja de 25 G y mantener a 37 ° C.
2. Prepare 10 mM estéril _solución de CaCl2 para la reticulación del alginato en la encapsulación de tejido y calentar a 37 º C.
3. Prepare 1 ml de medio de cultivo (αMEM + 5 unidades de penicilina y estreptomicina 5 mg / ml) por pocillo en una placa de 24 p....

Discusión

El desarrollo de un sistema de órganos en tres dimensiones utilizando los hidrogeles de alginato de la cultura representa un método versátil para el análisis de muchos tipos diferentes de tejidos a partir de una amplia variedad de organismos. El uso de cultivos en 3D se puede extender a los campos de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, ya que proporciona un andamio en el que las células pueden crecer ^11. En la actualidad, nuestro laboratorio está pasando por los estudios iniciales con los ovario.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Leibovitz medio L-15	Gibco	11415
αMEM medio	Gibco	12000-022
Alginato de sodio	NovaMatrix
Cacodilato de sodio	Sigma Aldrich	C0250
Malla de polipropileno de fibra	McMaster Carr		45 "rollo de ancho; 0,0041" apertura
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Penicilina / estreptomicina	Gibco	15070-063
Alginato liasa	Sigma Aldrich	A1603
A1603	Sigma Aldrich	C9697	De Clostridium histolyticum
Albúmina de suero bovino	MP Biomedicals	103700
De suero fetal bovino	Gibco	Gibco
SU solución	Roche	11074547001	Insulina / transferrina / selenito de sodio
Citoqueratina 8 de anticuerpos	Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma	TROMA-1	El uso de 1:200
DAPI	Vector de Laboratorios	H1200
Bromodeoxyuridine	Sigma	B50002-1G	Concentración final de 10 M