Alginat Hydrogeler för tredimensionella Organ Kultur äggstockarna och äggledarna

Summary

Kultur av normala celler i sina tredimensionella sammanhang representerar en alternativ metod för att studera tidiga händelser som krävs för cellulär omvandling och Tumörgenesens. Denna metod används för att odla normala äggstockar och oviductal celler för att studera tidiga händelser i äggstockscancer formation.

Abstract

Äggstockscancer är den femte vanligaste orsaken till dödsfall i cancer hos kvinnor och har en 63% dödlighet i USA ^1. Den celltyp ursprungsbeteckningar för äggstockscancer är fortfarande aktuella och kan vara antingen äggstockscancer ytan epitelet (OSE) eller distala epitelet i äggledaren fimbriae ^2,3. Odling av normala celler som primär kultur in vitro kommer att möjliggöra för forskare att modell specifika förändringar som kan leda till äggstockscancer i olika epitel, vilket definitivt avgöra cellen typ av ursprung. Detta kommer att möjliggöra utveckling av mer exakta biomarkörer, djurmodeller med vävnad-specifika genen förändras, och bättre förebyggande strategier riktade mot denna sjukdom.

Att upprätthålla normala celler i alginat hydrogel främjar kortsiktiga in vitro-kultur av celler i sina tredimensionella sammanhang och möjliggör införandet av plasmid-DNA, siRNA och små molekyler. Genom att odla organ i bitar som kommer från strategiska snitt med skalpell, flera kulturer från ett enda organ kan genereras, vilket ökar antalet försök från ett enda djur. Dessa nedskärningar modell aspekter av ägglossningen som leder till spridning av OSE, som förknippas med äggstockscancer bildas. Celltyper som OSE, som inte växer bra på plast ytor kan odlas med denna metod och underlätta utredning av normala cellulära processer eller de tidigaste händelserna i cancer bildas ^4.

Alginat hydrogeler kan användas för att stödja tillväxten av många typer av vävnader ^5. Alginat är en linjär polysackarid som består av upprepade enheter β-D-mannuronic syra och α-L-guluronic syra som kan tvärbunden med kalciumjoner, vilket resulterar i en mild gelbildande handling som inte skadar vävnaderna ^6,7. Liksom andra tredimensionella matriser cellodling som Matrigel ger alginat mekaniskt stöd för vävnader, men proteiner är inte reaktivt med alginat matris, och fungerar därför alginat som en syntetisk extracellulär matris som inte initiera cellsignalering ^5. Den alginat hydrogel flyter i standard cellodlingsmedium och stödjer arkitekturen i vävnad tillväxt in vitro.

En metod presenteras för beredning, separation, och inbäddning av äggstockscancer och oviductal organdelar i alginat hydrogeler, som kan hållas i kultur i upp till två veckor. Den enzymatiska versionen av celler för analys av proteiner och RNA prover från orgeln kulturen beskrivs också. Slutligen är tillväxten av primära celltyper möjligt utan genetiska immortalisering från möss och tillstånd utredarna att använda knockout och transgena möss.

Protocol

1. Ovarian dissektion och vävnad isolering Bered en 0,5% (w / v) lösning av natriumalginat, förbereda ur en modifierad version av det protokoll som tidigare beskrivits 5, med hjälp av sterila PBS och värme till 37 ° C. Blanda genom inversion eller vagga, men inte virvel. Rita alginat i en 1 ml spruta med en 25 G-nål och bibehålla vid 37 ° C. Förbered 10 mM steril CaCl 2 lösning för broarna alginat på vävnaden inkapsling och värm till 37 ° C. Förbered …

Discussion

Utvecklingen av en tredimensionell organsystem kultur-systemet utnyttjar alginat hydrogel är en mångsidig metod för att analysera många olika typer av vävnad från en mängd olika organismer. Användandet av 3D-kulturer kan utökas till områdena tissue engineering och regenerativ medicin, eftersom det ger en klätterställning som celler kan växa ^11. För närvarande är vårt laboratorium som genomgår grundläggande studier med humana äggstockar och äggledare vävnad, men har kultur av mänskliga o…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Leibovitz L-15 medium	Gibco	11415
αMEM medium	Gibco	12000-022
Sodium alginate	Novamatrix
Sodium cacodylate	Sigma Aldrich	C0250
Polypropylene mesh fiber	McMaster Carr		45″ wide roll; 0.0041″ opening
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Penicillin/streptomycin	Gibco	15070-063
Alginate lyase	Sigma Aldrich	A1603
A1603	Sigma Aldrich	C9697	From Clostridium histolyticum
Bovine serum albumin	MP Biomedicals	103700
Fetal bovine serum	Gibco	Gibco
ITS solution	Roche	11074547001	Insulin/transferrin/sodium selenite
Cytokeratin 8 antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-1	Use at 1:200
DAPI	Vector Labs	H1200
Bromodeoxyuridine	Sigma	B50002-1G	Final concentration 10 μM