Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps
Summary
Elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie werd gebruikt om stikstofoxide te detecteren van runderen aorta endotheelcellen en superoxide radicaal anion van menselijke neutrofielen met behulp van ijzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe (MGD)<sub> 2</sub> En 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO respectievelijk.
Abstract
Reactief stikstof / oxygen species (ROS / RNS) bij lage concentraties spelen een belangrijke rol in het reguleren van cel-functie, signalering, en immuunrespons, maar in niet-gereguleerde concentraties schadelijk zijn voor de levensvatbaarheid van de cellen 1, 2. Terwijl levende systemen hebben zich ontwikkeld met endogene en voedingssupplementen antioxidant verdedigingsmechanismen om ROS generatie te reguleren, worden ROS continu geproduceerd als natuurlijke bijproducten van de normale stofwisseling van zuurstof en kan oxidatieve schade aan biomoleculen wat resulteert in verlies van de functies van eiwitten, DNA-splitsing, of lipide veroorzaken peroxidatie 3, en uiteindelijk tot oxidatieve stress leidt tot cel letsel of de dood 4.
Superoxide radicaal-anion (O 2 • -) is de belangrijkste voorloper van enkele van de meest oxiderende soorten bekend zijn in biologische systemen zoals peroxynitriet en hydroxyl radicalen. De generatie van O 2 • – signaleert de eerste tekenen van oxidatieve burst, en daarom, its detectie en / of opslag in biologische systemen is belangrijk. In deze demonstratie, O 2 • – werd gegenereerd op basis van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN). Door chemotactische stimulatie met forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) PMN genereert O 2 • – activering van nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) oxidase 5.
Stikstofoxide (NO) synthase die wordt geleverd in drie isovormen, zoals induceerbare-, neuronale-en endotheel-NOS, of iNOS, nNOS of eNOS, respectievelijk, katalyseert de omzetting van L-arginine tot L-citrulline, met behulp van NADPH op NO 6 te produceren . Hier wordt gegenereerd NO uit endotheelcellen. Onder oxidatieve stress, kan eNOS bijvoorbeeld schakelen van de productie van NO tot O 2 • – in een proces dat ontkoppeling, waarvan wordt aangenomen veroorzaakt wordt door oxidatie van heem 7 of co-factor, tetrahydrobiopterinedeficiëntie (BH 4) 8.
Er zijn weinigbetrouwbare werkwijzen voor de detectie van vrije radicalen in biologische systemen, maar beperkt door de specificiteit en gevoeligheid. Spin trapping wordt gebruikt voor de identificatie van vrije radicalen en omvat de additiereactie van een groep een spin trap die een aanhoudende rotatie adduct dat gedetecteerd kan worden met elektronen paramagnetische (EPR) spectroscopie. De verschillende radicale adducten vertonen opvallende spectrum dat kan worden gebruikt om de radicalen worden gegenereerd identificeren en kan een schat aan informatie over de aard en de kinetiek van de radicale productie 9 geven.
De cyclische nitronen, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO 10 de fosforylchloride gesubstitueerde DEPMPO 11 en de ester gesubstitueerde, Empo 12 en BMPO 13 zijn alom gebruikt als rotatie vallen – deze rotatie vallen vertonen langere halfwaardetijden voor O 2 • – adduct. IJzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe (MGD) 2 </ Sub> wordt vaak gebruikt om NO te wijten aan hoge mate van adduct vorming en de hoge stabiliteit van de spin adduct 14 te vangen.
Protocol
Discussion
EPR spin-trapping is werkzaam in een breed scala van biomedische toepassingen voor het kwantificeren en het identificeren van vrije radicalen. Spin trapping zeer gevoelig voor het opsporen van radicalen bij concentraties variërend van nM tot uM waardoor het geschikt is voor toepassing in biologische systemen. De vorming van het paramagnetische adduct, NO-Fe2 +-MGD, is de basis van NO detectie via EPR. Fe 2 +-MGD reageert met NO snel 18 met een snelheid van ~ 10 6 M <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de NIH National Heart, Lung, and Blood Institute subsidie RO1 HL81248.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Clerch, L. B., Massaro, D. J. . Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. . Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. 2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties. Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -. U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
