Détection de l'oxyde nitrique et de l'anion superoxyde radical par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique à partir de cellules en utilisant des pièges de spin
Summary
Résonance paramagnétique électronique (RPE) a été utilisé pour détecter l'oxyde nitrique à partir de cellules endothéliales aortiques bovines et de l'anion superoxyde radical de neutrophiles humains en utilisant le fer (II)-N-méthyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD)<sub> 2</sub> Et de 5,5-diméthyl-1-pyroroline-N-oxyde, DMPO, respectivement.
Abstract
Azote réactif / espèces oxygénées (ROS / RNS) à des concentrations faibles jouent un rôle important dans la régulation de la fonction des cellules, de signalisation, et la réponse immunitaire, mais à des concentrations non réglementés sont préjudiciables à la viabilité des cellules 1, 2. Alors que les systèmes vivants ont évolué avec endogènes et alimentaires mécanismes de défense antioxydants pour réglementer ROS génération, ROS sont produites en continu tant que sous-produits naturels du métabolisme normal de l'oxygène et peut causer des dommages oxydatifs à des biomolécules entraînant la perte de la fonction des protéines, coupure de l'ADN, ou des lipides peroxydation 3, et, finalement, à un stress oxydatif conduisant à des blessures ou la mort cellulaire 4.
Anion superoxyde radical (O 2 • -) est le précurseur d'majeure partie des espèces plus fortement oxydants connus dans des systèmes biologiques tels que le peroxynitrite radical hydroxyle et. La génération de O 2 • – signale le premier signe de la flambée oxydative, et, par conséquent, its de détection et / ou de séquestration dans les systèmes biologiques est important. Dans cette démonstration, O 2 • – a été générée à partir de polynucléaires neutrophiles (PMN). Grâce à la stimulation chimiotactique avec le phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA), PMN génère O 2 • – via l'activation de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase 5.
D'oxyde nitrique (NO) synthase qui se décline en trois isoformes, comme inductible, endothéliale et neuronale-NOS, ou iNOS, nNOS ou de eNOS, respectivement, catalyse la conversion de la L-arginine en L-citrulline, en utilisant le NADPH pour produire NO 6 . Ici, nous avons généré NO par les cellules endothéliales. Dans des conditions de stress oxydatif, eNOS par exemple, peut passer de la production de NO à O 2 • – dans un processus appelé découplage, qui est censé être causé par l'oxydation de l'hème 7 ou le co-facteur, tétrahydrobioptérine (BH 4) 8.
Il ya seulement quelquesméthodes fiables pour la détection de radicaux libres dans les systèmes biologiques, mais sont limités par la spécificité et la sensibilité. Piégeage de spin est couramment utilisé pour l'identification de radicaux libres et comprend la réaction d'addition d'un radical à un accepteur de spin formant un produit d'addition de spin persistant qui peut être détectée par résonance paramagnétique électronique (RPE). Les adduits différents radicaux présentent spectre distinctif qui peut être utilisé pour identifier les radicaux étant générées et peuvent fournir une mine de renseignements sur la nature et la cinétique de la production de radicaux 9.
Les nitrones cycliques, 5,5-diméthyl-pyrroline-N-oxyde, DMPO 10, l'phosphoryle substitué DEPMPO 11, et l'ester-substitué, EMPO 12 et 13, BMPO ont été largement utilisé comme pièges de spin – le spin-ci pièges présentant plus des demi-vies pour O 2 • – adduit. Fer (II)-N-méthyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) 2 </ Sub> est couramment utilisé pour piéger NO en raison de taux élevé de la formation d'adduits et la grande stabilité de l'adduit de spin 14.
Protocol
Discussion
Piégeage de spin EPR a été employé dans un large éventail d'applications biomédicales pour la quantification et l'identification des radicaux libres. Piégeage de spin est très sensible, capable de détecter les radicaux à des concentrations allant de nM à uM fait la rendant appropriée pour l'application dans les systèmes biologiques. La formation de l'adduit paramagnétique, NO-Fe 2 +-MGD, est à la base de non détection par l'intermédiaire d'EPR. Fe 2 +-MGD…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le NIH Cœur nationale, Lung, and Blood Institute subvention RO1 HL81248.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Clerch, L. B., Massaro, D. J. . Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. . Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. 2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties. Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -. U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
