Résonance paramagnétique électronique (RPE) a été utilisé pour détecter l'oxyde nitrique à partir de cellules endothéliales aortiques bovines et de l'anion superoxyde radical de neutrophiles humains en utilisant le fer (II)-N-méthyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD)<sub> 2</sub> Et de 5,5-diméthyl-1-pyroroline-N-oxyde, DMPO, respectivement.
Azote réactif / espèces oxygénées (ROS / RNS) à des concentrations faibles jouent un rôle important dans la régulation de la fonction des cellules, de signalisation, et la réponse immunitaire, mais à des concentrations non réglementés sont préjudiciables à la viabilité des cellules 1, 2. Alors que les systèmes vivants ont évolué avec endogènes et alimentaires mécanismes de défense antioxydants pour réglementer ROS génération, ROS sont produites en continu tant que sous-produits naturels du métabolisme normal de l'oxygène et peut causer des dommages oxydatifs à des biomolécules entraînant la perte de la fonction des protéines, coupure de l'ADN, ou des lipides peroxydation 3, et, finalement, à un stress oxydatif conduisant à des blessures ou la mort cellulaire 4.
Anion superoxyde radical (O 2 • -) est le précurseur d'majeure partie des espèces plus fortement oxydants connus dans des systèmes biologiques tels que le peroxynitrite radical hydroxyle et. La génération de O 2 • – signale le premier signe de la flambée oxydative, et, par conséquent, its de détection et / ou de séquestration dans les systèmes biologiques est important. Dans cette démonstration, O 2 • – a été générée à partir de polynucléaires neutrophiles (PMN). Grâce à la stimulation chimiotactique avec le phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA), PMN génère O 2 • – via l'activation de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase 5.
D'oxyde nitrique (NO) synthase qui se décline en trois isoformes, comme inductible, endothéliale et neuronale-NOS, ou iNOS, nNOS ou de eNOS, respectivement, catalyse la conversion de la L-arginine en L-citrulline, en utilisant le NADPH pour produire NO 6 . Ici, nous avons généré NO par les cellules endothéliales. Dans des conditions de stress oxydatif, eNOS par exemple, peut passer de la production de NO à O 2 • – dans un processus appelé découplage, qui est censé être causé par l'oxydation de l'hème 7 ou le co-facteur, tétrahydrobioptérine (BH 4) 8.
Il ya seulement quelquesméthodes fiables pour la détection de radicaux libres dans les systèmes biologiques, mais sont limités par la spécificité et la sensibilité. Piégeage de spin est couramment utilisé pour l'identification de radicaux libres et comprend la réaction d'addition d'un radical à un accepteur de spin formant un produit d'addition de spin persistant qui peut être détectée par résonance paramagnétique électronique (RPE). Les adduits différents radicaux présentent spectre distinctif qui peut être utilisé pour identifier les radicaux étant générées et peuvent fournir une mine de renseignements sur la nature et la cinétique de la production de radicaux 9.
Les nitrones cycliques, 5,5-diméthyl-pyrroline-N-oxyde, DMPO 10, l'phosphoryle substitué DEPMPO 11, et l'ester-substitué, EMPO 12 et 13, BMPO ont été largement utilisé comme pièges de spin – le spin-ci pièges présentant plus des demi-vies pour O 2 • – adduit. Fer (II)-N-méthyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe (MGD) 2 </ Sub> est couramment utilisé pour piéger NO en raison de taux élevé de la formation d'adduits et la grande stabilité de l'adduit de spin 14.
Piégeage de spin EPR a été employé dans un large éventail d'applications biomédicales pour la quantification et l'identification des radicaux libres. Piégeage de spin est très sensible, capable de détecter les radicaux à des concentrations allant de nM à uM fait la rendant appropriée pour l'application dans les systèmes biologiques. La formation de l'adduit paramagnétique, NO-Fe 2 +-MGD, est à la base de non détection par l'intermédiaire d'EPR. Fe 2 +-MGD…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par le NIH Cœur nationale, Lung, and Blood Institute subvention RO1 HL81248.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |