Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model
Summary
Met behulp van kwantitatieve PCR, we zien hoe de gevestigde chick CAM-model kan worden gebruikt om kwantitatief analyseren van de uitzaaiing van menselijke tumorcellen naar verre organen.
Abstract
Tijdens de metastase verspreiden kankercellen uit de primaire tumor, binnen te dringen in de omliggende weefsels, en de verspreiding naar verre organen. Metastase is een complex proces dat kan gaan om vele soorten weefsel, overspanning variabele periodes en zich vaak diep in organen, waardoor het moeilijk te onderzoeken en te kwantificeren. Bovendien is de effectiviteit van de metastatische proces beïnvloed door de verschillende stappen in de metastatische cascade waardoor het moeilijk is om de bijdrage van een enkel aspect van de tumor cel gedrag te evalueren. Als gevolg hiervan zijn metastase testen vaak uitgevoerd in proefdieren om een realistische context noodzakelijk om in te studeren metastase te bieden. Helaas zijn deze modellen nog verder gecompliceerd door hun complexe fysiologie. Het kuiken embryo is een uniek in vivo model dat veel beperkingen overwint aan het bestuderen van metastase, te wijten aan de bereikbaarheid van de chorion-membraan (CAM), een goed gevasculariseerd extra-embryonaal weefsel bevindt zich onder de eierschaal die ontvankelijk is voor de xenografting van tumorcellen (figuur 1). Aangezien het kuiken embryo is natuurlijk immunodeficiënte, de CAM ondersteunt gemakkelijk de innesteling van zowel de normale en tumor weefsel. Het belangrijkste is dat het aviaire CAM ondersteunt met succes de meeste kankercellen kenmerken, zoals groei, invasie, angiogenese, en herinrichting van de micro-omgeving. Dit maakt het model bijzonder nuttig voor het onderzoek van de routes die leiden tot kanker metastase en de reactie van uitgezaaide kanker aan nieuwe potentiële geneesmiddelen te voorspellen. De detectie van verspreide cellen door soortspecifieke Alu PCR maakt het mogelijk om kwantitatief te beoordelen uitzaaiingen in organen die zijn gekoloniseerd door zo weinig als 25 cellen. Met behulp van de Human epidermoïde carcinoom cellijn (HEp3) gebruiken we dit model tot spontane uitzaaiing van kankercellen te analyseren naar verre organen, waaronder het kuiken lever en longen. Bovendien, met behulp van de Alu-PCR-protocol tonen we aan de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de test als een instrument voor het analyseren en intravasation, arrestatie, extravasatie, en kolonisatie te kwantificeren als individuele elementen van metastase.
Protocol
Discussion
De chick CAM is gebruikt voor decennia als een modelsysteem om de verschillende aspecten van kanker biologie en metastatische progressie te bestuderen. Principe evaluatie van gemetastaseerd vaardigheden zijn uitgevoerd in dit model door een verscheidenheid van groepen, waaronder de analyse van de rusttoestand (Aguirre Ghiso et al., 1999;. Ossowski en Reich, 1983), remodellering van het weefsel (Deryugina et al., 2005;. Hahn-Dantona . et al., 1999), en metastase (Zijlstra et al., 2008;…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Tyson Foods Inc erkennen voor ruim het verstrekken van de bevruchte eieren. Shanna Arnold speelde een belangrijke rol tijdens de opnames van dit protocol. Trenis Palmer werd gesteund door de National Institutes of Health onder de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door CCSRI Grant # 700537 om JDL en NIH / NCI verlenen # CA120711-01A1-01A1 en CA120711 naar AZ.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
References
- Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
