Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy
Summary
Live-Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën kunnen worden geïmmobiliseerd op gelatine gecoate mica en beeld gebracht in een vloeistof met behulp van Atomic Force Microscopy (AFM).
Abstract
AFM is een hoge resolutie (nm schaal) imaging tool die mechanisch sondes een oppervlak. Het heeft de mogelijkheid om beeld cellen en biomoleculen, in een vloeibare omgeving, zonder de noodzaak om chemisch te behandelen van het monster. Om dit doel te bereiken, moet het monster voldoende houden aan de montage-oppervlak om de verwijdering te voorkomen door krachten uitgeoefend door de AFM te scannen cantilever tip. In veel gevallen succesvol beeldvorming hangt af van immobilisatie van het monster op de montage-oppervlak. Optimaal dienen immobilisatie worden minimaal invasieve aan het monster zodanig dat metabolische processen en functionele kenmerken niet in het gedrang komen. Door het bekleden van vers geknipt mica oppervlakken met varkens (varkens) gelatine, kan negatief geladen bacteriën worden geïmmobiliseerd op het oppervlak en afgebeeld in vloeibare door de AFM. Immobilisatie van bacteriële cellen op gelatine gecoate mica is het meest waarschijnlijk te wijten aan elektrostatische interactie tussen de negatief geladen bacteriën en de positief geladen gelatine. Verschillende factoren kunnen interfereren met bacteriële immobilisatie, inclusief de chemische bestanddelen van de vloeistof waarin de bacteriën zijn opgehangen, de incubatietijd van de bacterie op de gelatine gecoate mica, oppervlakte-eigenschappen van de bacteriële stam en het medium waarin de bacteriën worden afgebeeld. Over het algemeen is het gebruik van gelatine-gecoate mica vinden over het algemeen van toepassing voor de beeldvorming microbiële cellen.
Protocol
Discussion
Verschillende factoren kunnen van invloed zijn microbiële cel montage en beeldvorming door de AFM. De gelatine die wordt gebruikt voor het coaten van het mica is belangrijk. Commerciële gelatine is geïsoleerd uit een aantal van de gewervelde dieren waaronder vissen, koeien en varkens. Zowel de oorsprong en de verwerkingsmethode bepalen de gelatine de geschiktheid voor bacteriële immobilisatie. Tal van bronnen en vormen van gelatine werden geëvalueerd op hun effectiviteit in immobiliseren bacteriën [1]. De twee mee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek wordt gesponsord door het Bureau van biologische en milieu-onderzoek, het Amerikaanse ministerie van Energie en door subsidies van de Virginia Commonwealth's Health Research Board. Oak Ridge National Laboratory wordt beheerd door UT-Battelle, LLC, voor het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract nummer DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Gelatin | Sigma, St. Louis, MO | G6144, G2625 or G2500 |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies, Tempe, AZ | |
| AFM cantilevers | Veeco, Santa Barbara, CA | MLCT-AUHW |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O’Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
