Bakteriell Immobilisering for Imaging genom atomkraftsmikroskopi
Summary
Live gramnegativa och grampositiva bakterier kan immobiliseras på gelatin-belagda glimmer och avbildas i flytande med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM).
Abstract
AFM är en hög upplösning (nm skala) imaging verktyg som mekaniskt sonder en yta. Det har förmågan att bilden celler och biomolekyler, i en vätska miljö, utan att kemiskt behandla provet. För att uppnå detta mål måste provet hålla tillräckligt för att monteringsytan för att förhindra att tas bort av krafter som skanning AFM fribärande spets. I många fall beror lyckad avbildning av fixering av provet till monteringsytan. Optimalt ska immobilisering vara minimalt invasiva till provet så att metaboliska processer och funktionella egenskaper inte äventyras. Genom beläggning nyligen klyvs glimmer ytor med svin (gris) gelatin, kan negativt laddade bakterier inte kunna rubbas på ytan och avbildade i flytande genom AFM. Fixering av bakterieceller på gelatin belagda glimmer beror sannolikt på grund av elektrostatisk växelverkan mellan negativt laddade bakterier och de positivt laddade gelatin. Flera faktorer kan påverka bakteriell immobilisering, inklusive kemiska beståndsdelar av vätskan där bakterier är tillfälligt, inkubationstiden för bakterier på gelatin belagda glimmer, ytegenskaper av bakteriestam och mediet där bakterier är avbildade. Totalt sett är användningen av gelatin-belagda glimmer befunnits vara allmänt tillämpliga för celler avbildning mikrobiell.
Protocol
Discussion
Olika faktorer kan påverka mikrobiell cell montering och avbildning av AFM. Det gelatin som används för beläggning av glimmer är viktigt. Kommersiella gelatin är isolerad från ett antal ryggradsdjur inklusive fisk, kor och grisar. Både ursprung och bearbetningsmetod bestämma gelatin lämplighet för bakteriell immobilisering. Många källor och typer av gelatin utvärderades för deras effektivitet i immobilisera bakterier [1]. De två mest effektiva gelatin som befanns vara Sigma G-6144 och G-2625. Härstammar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning är sponsrad av byrån för bio-och miljöforskning, US Department of Energy och genom bidrag från Virginia Commonwealth Health Research Board. Oak Ridge National Laboratory förvaltas av UT-Battelle, LLC, för US Department of Energy i Kontrakt nr DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Gelatin | Sigma, St. Louis, MO | G6144, G2625 or G2500 |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies, Tempe, AZ | |
| AFM cantilevers | Veeco, Santa Barbara, CA | MLCT-AUHW |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O’Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
