בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

Summary

אנו מדגימים את ייצור של השלב בעלות נמוכה קריוגני שתוכנן מיקרוסקופים האור המוחזר ביותר. שלב זה במעבדה בנוי קריוגני מאפשרת הדמיה המצטרף יעיל ואמין בין cryo-אור cryo-אלקטרונים מיקרוסקופית.

Abstract

צימוד של מיקרוסקופיה cryo-אור (cryo-LM) ו במיקרוסקופ אלקטרונים cryo-(cryo-EM) מהווה מספר יתרונות להבנת הדינמיקה הסלולר ultrastructure. ראשית, תאים ניתן הדמיה בסביבה יליד ליד טכניקות שניהם. שנית, בשל תהליך vitrification, דגימות נשמרים על ידי immobilization פיזי מהיר יותר מאשר קיבוע כימי איטי. שלישית, הדמיה מדגם זהה עם שני cryo-LM ו cryo-EM מספק המתאם של נתונים מתא בודד, ולא השוואה של "מדגמים מייצגים". למרות היתרונות הללו ידועים ממחקרים קודמים, השימוש הנרחב המצטרף cryo-LM ו cryo-EM נשאר מוגבל בשל חשבון והמורכבות של רכישת או בניית מיקרוסקופ מתאים קריוגני שלב אור. כאן אנו מדגימים את הרכבה, ושימוש בשלב קריוגני יקר זה יכול להיות מפוברק במעבדה כל פחות מ 40 $ עם חלקים למצוא בכתובת חומרה מקומיים וחנויות מכולת. שלב זה cryo-LM מיועד לשימוש עם מיקרוסקופים האור המוחזר כי מצוידים זמן האוויר מטרות עבודה מרחוק. עבור המצטרף cryo-LM ו cryo-EM מחקרים, אנו להתאים את השימוש של פחמן סטנדרטי מצופה 3 מ"מ cryo-EM רשתות כמו תומך הדגימה. לאחר adsorbing המדגם לרשת, פרוטוקולים הוקמה בעבר עבור vitrifying המדגם והעברת / טיפול לרשת הן בעקבות להתיר טכניקה רב הדמיה. כתוצאה מכך, התקנה זו מאפשרת לכל מעבדה עם מיקרוסקופ האור המוחזר כדי לקבל גישה המצטרף הדמיה ישירה של דגימות hydrated קפואים.

Protocol

1. ייצור והרכבה הנח את מפזר החום אלומיניום בתוך 22.96 ס"מ (9 ") במחבת העוגה כ 2 ס"מ מהצד של המחבת, כפי שמוצג באיור 1c שימוש בטוש שחור, חורים סימן עבור מפזר החום אלומיניום הערה:.. אם אלומיניום בלוק (לרכוש חנות גרוטאות מתכת המקומית או באינטרנט http://www.onlinemetals.com ) לא מגיע עם טרום קדח חורים, תצטרך לארגן יש חורים שנקדחו ו המשוקעים לפני שלב 1 כדי לאבטח את אלומיניום לחסום למחבת את העוגה. השתמשנו 5 חורים כדי לאבטח את גוש לפלטפורמת ו 4 חורים נוספים כדי לאפשר גז בועות חנקן לברוח תחת האלומיניום. מניחים את תיבת cryo-רשת ליד המיקום של מפזר החום אלומיניום לסמן את החריץ ואת כל צד. לקדוח חורים טייס לכל תפקיד מסומן באמצעות קצת # 17 לקדוח חורים החום אלומיניום כיור קצת # 35 לקדוח חורים cryo-רשת התיבה. הר חום אלומיניום כיור באמצעות 5 – # 10, 1.9 ס"מ (3 / 4 ") ראש שטוח מחוררת ברגים ואומים המקביל כמו גם 15 – # 10 מנקי מניחים שתי דיסקיות מתחת לבלוק אלומיניום השלישי על הישבן של. פשטידת מחבת של כל חור הערה:. המסוכך בחו"ל של גוש אלומיניום בסמוך לאזור הצפייה עלולה לגרום לתנודות המגבילים יכולות הדמיה של הבמה בדוק כדי לוודא שכל הברגים הרכבה הם הידקו בחוזקה.. הכנס 3 – # 4, 0.95 ס"מ (3 / 8 ") בסיבוב ברגים מחוררת ואגוזים המקביל מהישבן של פאן פאי לשמש cryo-רשת התיבה הר. קלטת 4 מקלות אכילה יחד בזוגות עם המקל על גבי מחילות. כל זוג Tape לקצוות מרוחקים של המחבת עוגת לשמש מפרידי. משטח רטוב העליון ובחלק התחתון של העוגה עוגת מחבתות בהתאמה עם DDH 2 O. מלאו את המחבת עוגה עם שתי שכבות של ספריי קצף בידוד. הרטבת כל שכבה לפני שהולכים לשלב הבא. הקש את התבנית לתוך הקצף. תהפכו את מחבתות הפוך ולחץ על מחבת את העוגה עד מפרידי הקשר את התבנית. מניחים חפץ משוקלל על גבי מחבת את העוגה ולתת לשבת לילה לרפא. בעזרת סכין משוננת, לחתוך עודף יבשים ספריי קצף בידוד מקצה מחבתות והסר את מקלות אכילה. מורידים את הסיר העוגה מהתבנית את העוגה. במחבת עם גוף הקירור העוגה אלומיניום מבודד עכשיו יהיה המכונה "שלב קריוגני" (איור 1 א). מניחים לוח פלסטיק שקוף (כל צבע יותר מאשר 3 מ"מ עובי) מעל הבמה קריוגני. סמן בטוש שחור את מיקומו של הר cryo-רשת התיבה על ידי ציור עיגול כ -1.5 פעמים הקוטר של עגול אחד cryo-רשת התיבה. לגזור חור עם 1.9 ס"מ (3 / 4 ") ראה חור. הלוח זה יהיה המכונה" מסך הטעינה "(איור 1b). שים ללוח שקוף חדש מעל הבמה קריוגני ומניחים על מיקרוסקופ עם מפזר החום ישירות תחת עדשות אובייקטיבי. בטוש שחור, סימן את הנתיב של היעדים כפי שהם לסובב. גזור לאורך הקו המסומן הסרת חצי מעגל מקצה הלוח. ניתן להשיג זאת עם פאזל או בעזרת 7.62 ס"מ (3 ") חור ראיתי מספר פעמים כפי שמוצג בסרטון. לבסוף לחתוך חור 1.9 ס"מ (3 / 4 ") במרחק חצי העיגול, אבל עדיין בתוך השטח של המנה. זה יהיה נמל למילוי חנקן נוזלי (באעכליה 2) אם תוך ירידה ברמות הדמיה. הלוח הזה יופנה בשם "מסך הצפייה" (איור 1 ג'). 2. לדוגמא הכנה מדולל שלב יומן שמרים תאים שגודלו סינתטי (SC) התקשורת מלאה הריכוז המתאים של 1×10 6 תאים / מ"ל מים. 2 מ"ל של השמרים בדילול הם pipetted על R2 / 1 400 רשת המחוררת פחמן מצופה נחושת cryo-EM רשת (ספקי SPI, במערב צ'סטר, פנסילבניה) וכן מותר לספוג למשך 15 שניות. כתם משם נוזל עודף מפני השטח לרשת על ידי נגיעה בחלק האחורי של הרשת לפיסת קרוע של רקמה רכה תאית (Kimwipe) למשך 2 שניות. אם יש צורך, הרשת ניתן לכבס עם 3 טיפות μL של מים (1-3 פעמים), ואת הרשעים משם כמו בשלב 3 של סופג מאחור. לשטוף לפני הגמר, המדגם הוא נטען לתוך המקפיא לצלול פנאומטי והרשת תלוי נשטף כמו בשלב 2.4. לאחר סופג את הרשת עם נייר קרוע (Kimwipe) כדי להסיר את רוב המים מפני השטח, הרשת הוא צלל לתוך באעכליה 2 מקורר אתאן נוזלי והועברו תיבת cryo-רשת אחסון עבור הערה: 1. חשוב להשאיר שכבה של נוזל דק ככל האפשר על פני השטח כדי למנוע התייבשות המדגם. לא נכון יהיה גם סופג לייבש את המדגם או לעזוב קרח אטומה האלקטרון הקורה. 3. Cryo-Light מיקרוסקופית מלאו את הבמה עם קריוגניבאעכליה 2 במהירות לכסות עם מסך הטעינה (לוח פלסטיק עם 1.9 ס"מ בודד (3 / 4 ") חור). לאחר מתכת מגיע באעכליה 2 טמפרטורה, להעביר את תיבת cryo-רשת דרך 1.9 ס"מ (3 / 4 ") חור של המסך טעינה לתוך להעביר את הר שנוצר על ידי 3 ברגים המתואר A5 חלק. הברג החוצה את תיבת cryo-רשת מבעל שלה להסיר את בעל גישה משופרת. שמור בעל cryo-רשת בתיבה תחת באעכליה 2 בתוך דיואר נפרדת עד שלב 3.10. תיבת cryo-רשת צריך גם להיות כל הזמן תחת באעכליה 2 רשת כדי למנוע התחממות המדגם. . דיו באעכליה 2 בשלב קריוגני ממש מתחת העליון של מפזר החום אלומיניום הערה: באעכליה 2 רמות יש לבדוק מעת לעת ומילא בתהליך הדמיה כדי להבטיח באעכליה 2 הוא ברציפות במגע עם גוף הקירור. באופן כללי, מילוי מתרחשת כל 10 דקות דרך נמל למלא את המסך לצפייה. טרום מגניב קצה פינצטה ב באעכליה 2, ולאחר מכן להעביר לרשת שלך (ים) על גבי משטח שטוח הצפייה של הכיור אלומיניום חום עם פינצטה, באמצעות 1.9 ס"מ (3 / 4 ") חור של מסך הטעינה. בזהירות להזיז את cryo-הבמה מתחת פתחים המטרה של מיקרוסקופ אור משתקף. מקמו את מסך הצפייה שקוף על גבי מסך הטעינה. ואז לאט לאט להסיר את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מתחת הערה צפייה במסך:. בשלב זה, המדגם הוא הפגיע ביותר. כל זרמי אוויר סביב המיקרוסקופ צריך להיות ממוזער, ביניהם: נשימה, פתח את הדלת הסמוכה, אנשים חולפים, וכו 'אנו ממליצים לובש facemask או תלוי מגן פנים שקוף מתחת למיקרוסקופ מהעיניות כאמצעי זהירות. סובב את העדשות אובייקטיבית לתוך הסביבה גז קר חנקן של הבמה cryo ולסרוק למדגם על שטח חום שטוחה כיור הצפייה. באמצעות אור רגיל בהיר בשדה מיקרוסקופיה להתמקד טכניקות על רשת עם מטרה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את מרכז ולקחת תמונה כללית. מפרט לגבי עדשות מיקרוסקופ אור משמש לצורך הניסוי הזה המפורטים בסעיף חומרים ניסויית. הערה: באעכליה 2 לא בא במגע עם עדשות אובייקטיבי יש לנו עדיין לראות את ההשפלה של תמונות או נזק עדשות מהשפעות קירור . להתמקד בהגדלה גבוהה על שטח של עניין לרכוש נתונים עם שדה בהיר, שדה חשוך, אור מקוטב או דימות פלואורסצנטי. הקפד לרשום את המיקום של אזור הריבית על התמונה שדה נמוך בהיר הגדלה עבור מתאם בעתיד. אם כל אמצעי הזהירות המפורטים לעיל עבור מילוי באעכליה 2 הם אחריו, ולאחר מכן לחץ חיובי החנקן מתאדים מספיקה כדי לשמור על הסביבה זיהום חופשי (עצמאי של החדר לחות) למשך הדמיה. פעם סיים, להחליף את מסך הטעינה על ידי הזזה זה מעל מסך התצוגה. הסר את המסך לצפייה על ידי האטת מחליק אותו מתחת למסך הטעינה. הסר את הבמה cryo מן מיקרוסקופ עם פינצטה מקורר מראש, להעביר את הרשת בחזרה אל תיבת cryo-לרשת. בורג בעל cryo-רשת התיבה לתוך תיבת cryo-רשת לאטום נגד הסביבה ולהעביר את המחזיק ל דיואר LN2 לאחסון הדמיה בעתיד. 4. מיקרוסקופית אלקטרונים cryo- בעקבות טכניקות סטנדרטיות והקים, לטעון את רשת מדגם לתוך המחזק cryo-EM העברה תוך שמירה על הדגימה בטמפרטורת חנקן נוזלי בכל עת. הכנס את cryo-מחזיק עם רשת מדגם לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. לאור הגדלה מתאים נמוכה (50-500x הגדלה נומינלית), למצוא את המרכז של הרשת המדגם. השתמש שנאספו בעבר נמוך cryo-LM הגדלה נתונים צעד 3.7 כדי לקבוע את הכיוון היחסי של כרטיסיות המרכזי של רשת נחושת (כמתואר באיור 2), לזהות אזורים המדויק של עניין המתאם. המשך יישור מיקרוסקופ, במינון נמוך cryo-EM הדמיה איסוף הנתונים. 5. נציג תוצאות השלב קריוגני (איור 1 א) היא דרך יעילה לאיסוף cryo-LM נתונים עבור מיקרוסקופיה cryo-פלואורסצנציה וניתוח cryo-LM/cryo-EM גומל. איור 2 מראה כיצד שילוב של תמונות נמוך וגבוה cryo-LM ההגדלה מאפשר לך לבנות מפות התייחסות לכוון אותך לאזורים ספציפיים cryo-EM. כתוצאה cryo-LM התייחסות המפה (איור 2b) נוצל במהלך רכישת נתונים cryo-EM לאתר אזורים המדויק שמוצג באיור 3. באיור 1. שלב קריוגני. א) הפריסה של השלב קריוגני מורכב העברת cryo-רשת תיבה הר הצביעו wהחץ ith לבן מפזר החום אלומיניום. רשתות מועברים תחת באעכליה 2 מתוך תיבת cryo-לרשת והניח ישירות על אזור התצוגה הכיור של חום, כמצוין על ידי החץ השחור. ב) תמונה המתארת ​​את השלב קריוגני עם טעינת מסך. חור במסך הטעינה ממוקם ישירות מעל cryo-רשת התיבה הר משמש ליציאת להעביר דגימות להעברת דגימות תיבת cryo-הרשת לאזור מדגם צפייה על מפזר החום עם פינצטה. ג) קריוגני בשלב בעמדה תחת עדשות אובייקטיבי עם מסך צפייה במקום. נתק מיוחד על המסך מאפשר צפייה עדשות אובייקטיבי הנדנדה בקלות למצב מבלי להזיז את הבמה קריוגני. חור במסך הצפייה הרחק מאזור מדגם משמש באעכליה 2 למלא נמל לחדש באעכליה 2 רמות במידת הצורך. איור 2. ניווט LM-cryo ללימודי גומל.) בהגדלה נמוכה cryo-LM נוף של תאים שמרים דבק רשת מדגם. ב) אותה תמונה ב (א) ועליהן תמונה בהגדלה גבוהה הקרינה בשטח של עניין עם מצולע כתום מלא לציון מרכז של רשת המדגם. המרכז מורכב מקבוצה של ארבעה ריבועים, שלושה שיש לשונית מתכת נוספת הפתוח הלאה. במשך שלושה ריבועים עם לשונית מתכת נוספת, שני זוגות חולקים על הכרטיסייה על צירים ארוכים וקצרים להרכיב מרכז אסימטרי. מרכז זה אסימטרית ניתן לראות בפינה השמאלית העליונה שימשה כדי לציין את זווית סיבוב handedness של הרשת בין cryo-LM ו cryo-EM. מאחד נמוך התמונה הגדלה באזורים רבים של עניין ניתן לסמן ושימש המפה התייחסות לאתר אזורים זהים cryo-EM. ג) מוגדל הקרינה cryo-LM תמונה של האזור של עניין (ב). HTA1-CFP, סמן בטרמינל C-CFP היסטון, ניתן לראות מבנה punctate ירוק תיוג את מיקומו של הגרעין. ד) תמונה cryo-EM של האזור המקביל ב (ג). ברים סולם מייצגים 50 מיקרון. איור 3. מתאם של cryo-LM ו cryo-EM. שני שדות הראייה המתארת ​​שמרים תאים זהים בקורלציה עם שדה cryo-בהיר (א, ד), cryo-פלואורסצנטי (ב, ה), ו cryo-EM (ג, ו ). ברים סולם מייצגים 5 מיקרון.

Discussion

<p class="jove_content"> שימוש הבמה קריוגני שלנו הכנת המדגם טכניקות, מחקרים המתאם בין cryo-LM ו cryo-EM התערוכה מספר יתרונות על פני הגישות המסורתיות בטמפרטורת החדר, כולל אך לא מוגבל ל: קיבוע מהיר^1,2, הקטינה photobleaching³, וסריקה של שלמות המדגם לפני cryo-EM^4,5 או כימי קיבעון / הטבעה⁶. אחד צווארי בקבוק עבור cryo-EM איסוף נתונים הוא הזמן הנדרש הן העברת מדגם לתוך TEM ו לסרוק את הרשת כדי למצוא אזורים מתאימים לתמונה. עם רכישת נתונים מהירה של cryo-LM⁵, הזמן המוקדש למציאת תאים טוב יכול להיות מופחת במידה ניכרת. לפיכך, אנו יכולים לחסוך זמן וכסף ולצמצם את צוואר הבקבוק על ידי מראש סריקת מיפוי תחומי עניין cryo-LM.</p><p class="jove_content"> שלבי קריוגני יקר יותר או מורכבים עשוי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה cryo-LM. עם זאת, בשלב מפוברק כאן היא יותר ממספקת עבור יישומים רבים. אם cryo-LM הדמיה רשת העברות מדגם מבוצעות בזהירות כפי שמתואר בטקסט ווידאו, הדמיה מלאה זיהום חופשי יכול להיות מושלם. שיטה זו מאפשרת קשר ישיר של נתונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלקטרון באותו תא, אברון או מורכב macromolecular מפוזרים על התמיכה פחמן או בתוך קטע רקמה דקה⁷. יש לציין כי ערך בשלב זה קריוגני חורג מחקרים המצטרף cryo-LM/cryo-EM לתחום במיקרוסקופ אור כולה. שלב זה קריוגני הוא גם מתאים הן דוגמאות וצבעים עדינים fluorophore / כתמים⁸, נקודות קוונטיות, או החלבונים המתויגים fluorescently⁹ זה עשוי להיות לא יציב במהלך קיבוע כימי בטמפרטורה בחדר והטבעה עם glutaraldehyde ו paraformaldehyde. כתוצאה מכך, אנו מקווים כי זה שלב קריוגני תספק גישה גדולה יותר למעוניינים cryo-LM, שהיו בעבר נרתע גישה העלות מספקת.</p><p class="jove_content"<em> פתרון בעיות cryo-Light מיקרוסקופית</em</p><p class="jove_content"<em> 1. לדוגמה ספיחה:</em> מדגמים שונים יכולים להפגין משתנה מאפיינים ספיחה לתמוך פחמן. אתה עלול למצוא לנכון להשתמש בסוגים אחרים של רשתות תמיכה כגון פחמן רציפה, פחמן המחוררת, או רשתות מצופה formvar לתמיכה המדגם. בנוסף, אם המדגם הוא מחייב את הסורגים נחושת של הרשת ולא משטח הפחמן, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כימיה של פני השטח הפחמן על ידי דוגרים את הרשת עם סוכן הרטבה או על ידי זוהר ופריקה לפני כן המדגם.</p><p class="jove_content"<em> 2. שלב יציבות:</em> אם אתה מבחין הרטט, סביר להניח עקב הבמה מדגם להיות עמוסה עם משקל ולא המבעבע של LN2. המשקל הנוסף של שלב קריוגני, יכול לפעמים לגרום לתנודות בתדירות נמוכה לשדר לאורך הבמה מיקרוסקופ רגיל 3-ציר הנסיעה, להשפיע לרעה על דימות באמצעות טשטוש. זה יכול בקלות להיות מתוקן על ידי תמיכה לשלב נסיעה של מיקרוסקופ מלמטה עם או להרים מיני מתכווננת או מתאם מתכווננת עם בורג כפול נשק, כפי שמוצג בסרטון. שני אלה במנגנוני תמיכה מתכווננת אינטראקציה עם החלק הלא ניד של הבמה לנסוע ולכן עדיין היתרי X ו-Y ציר תרגום כנדרש הדמיה.</p

Materials

Table of specific reagents and equipment:

Name	Company	Catalog #	Comments	Cost
1 – 22.86 cm (9″) pie pan with sloped edge	Good Cook		Local grocery store	$4.39
1 – 22.86 cm (9″) cake pan	Good Cook		Local grocery store	$4.93
4 pairs of chopsticks			Local grocery store	$.50
1 – Great Stuff spray foam	Great Stuff		Local hardware store	$5.98
1 – 4cm x8cm x1cm block of aluminum			Local hardware store or metal scrap yard	$10.00
5 – #10 1.91 cm (3/4″) flat head slotted bolts w/ nuts			Local hardware store	$0.98
3 – #4 0.95 cm (3/8″) round slotted bolts w/ nuts			Local hardware store	$0.98
15 – #10 washers			Local hardware store	$0.98
2 – transparent plastic clipboards			Local office store	$6.84
1 – Cryo-EM grid box holder	Ted Pella	160-41		N/A
1 – Cryo-EM grid box handling rod	Ted Pella	160-46		N/A
1 – R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid	SPI Supplies	4340C-XA		N/A

Experimental materials

1. Yeast strain: Hta1-CFP::Kan (KSC-3382: MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP::KanMX6 from the Kaplan lab at UC Davis).
2. Cryo-Light Microscopy: Cryo-light microscopy images were taken on a Leica DM4000M reflecting microscope with a Leica DFC310 FX CCD camera. Bright Field, Dark Field and Fluorescence images were acquired using either a HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 N.A. air objective, a HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 N.A. air objective, a PL FLUOTAR 50x 0.55 N.A. air objective or a NPLAN 100x 0.75 N.A. air objective. Bright Field and Dark Field images used a 12V 100W tungsten lamp as the light source. For Fluorescence, an EL6000 UV lamp source was used in conjunction with a Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, D.M.: LP 505, S.F. BP 535/40 & LP 580) Filter Cube.
3. Cryo-Transmission Electron Microscopy: Cryo-EM images were acquired on a JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) operating at 200 KeV utilizing a Gatan 626 cryo-transfer holder (Gatan, USA). Micrographs were recorded at nominal magnifications of 50, 200, 1,200 and 4,000X on a 4,096 x 4,096 pixel Tietz CCD camera (TVIPS, Gauting, Germany).