High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em
Summary
Nós descrevemos um baixo custo, o método de alto rendimento para a tela para a atividade endoglucanase fúngicas em<em> E. coli.</em> O método se baseia em uma leitura visual simples de degradação do substrato, não necessita de purificação de enzimas, e é altamente escalável. Isto permite a avaliação rápida de grandes bibliotecas de variantes da enzima.
Abstract
Celulase enzimas (endoglucanases, cellobiohydrolases e β-glicosidases) hidrolisar a celulose em açúcares componente, que por sua vez podem ser convertidos em álcoois combustíveis 1. O potencial para hidrólise enzimática da biomassa celulósica para fornecer energia renováveis tem se intensificado os esforços para engenheiro de celulases para 2 econômica de produção de combustíveis. De particular interesse são celulases fúngicas 08/03, que já estão sendo utilizados industrialmente para alimentos e processamento de têxteis.
Identificar variantes ativa entre uma biblioteca de celulases mutante é fundamental para o processo de engenharia; mutantes ativa ainda pode ser testado para propriedades melhoradas e / ou sujeitos a mutagênese adicionais. Engenharia eficiente de celulases fúngicas tem sido dificultada pela falta de ferramentas genéticas para os organismos nativos e pelas dificuldades em expressar as enzimas em hospedeiros heterólogos. Recentemente, Morikawa e colaboradores desenvolveram um método para expressar em E. coli os domínios catalíticos de endoglucanases de H. jecorina 3,9, um fungo industrial importante, com a capacidade de secretar celulases em grandes quantidades. Funcional E. expressão coli também foi relatada por celulases de fungos, incluindo Macrophomina phaseolina 10 e Phanerochaete chrysosporium 11-12.
Nós apresentamos um método para triagem de alto rendimento da atividade endoglucanase fúngicas em E. coli. (Fig. 1) Este método usa o comum microbiana corante Congo Red (CR) para visualizar a degradação enzimática da carboximetilcelulose (CMC) de células que crescem em meio sólido. O ensaio de atividade requer reagentes de baixo custo, a manipulação mínima, e dá resultados inequívocos como zonas de degradação ("halos") no local da colônia. Embora uma medida quantitativa da atividade enzimática não pode ser determinado por este método, nós descobrimos que o tamanho do halo se correlaciona com atividade enzimática total do celular. Uma melhor caracterização de cada um dos clones positivos irá determinar, fitness proteína relativa.
Tradicionais bacteriana toda célula ensaios CMC / CR 13 envolvem a atividade derramando CMC agar contendo em colônias, que está sujeita a contaminação cruzada, ou culturas incubadas em poços de agar CMC, que é menos passível de experimentação em larga escala. Aqui nós relatamos um protocolo melhorado que modifica métodos de lavagem existentes 14 para atividade da celulase: células cultivadas em placas de ágar CMC são removidos antes da coloração CR. Nosso protocolo reduz significativamente a contaminação cruzada e é altamente escalável, permitindo a avaliação rápida de milhares de clones. Além de H. enzimas jecorina, temos expressa e selecionados variantes endoglucanase do Thermoascus aurantiacus e decumbens Penicillium (mostrado na Figura 2), sugerindo que este protocolo é aplicável às enzimas a partir de uma variedade de organismos.
Protocol
Discussion
O protocolo aqui descrito permite a identificação rápida e alta taxa de transferência de enzimas ativas, com manipulação mínima. Detecção de atividade é bastante sensível, e qualitativamente reflete a quantidade de atividade dentro da célula. Sua facilidade de uso torna este método adequado para uma ampla gama de bibliotecas de enzima, limitado apenas pela expressão funcional em E. coli. Além disso, o rastreio deste tipo de atividade não se restringe a celulases fúngicas, mas pode ser adaptado …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Gordon e Betty Moore Foundation e pela Iniciativa Ciência UNCF / Merck.
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
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