Biz mantar endoglucanase faaliyet için ekran için düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi tarif<em> E. coli.</em> Bu yöntem, substrat bozulması basit bir görsel okuma dayanır enzim saflaştırma gerektirmez ve yüksek ölçeklenebilir. Bu enzim varyantlarının büyük kütüphanelerin hızlı bir tarama sağlar.
Selülaz enzimleri (endoglucanases, cellobiohydrolases ve β-glukozidaz) da yakıt alkoller 1 dönüştürülebilir bileşeni şekerlerin içine hidroliz selüloz. Selülozik biyokütle yenilenebilir enerji sağlamak için enzimatik hidroliz potansiyeli, ekonomik yakıt üretimi 2 için sellülazlar mühendisi çabaları yoğunlaşmıştır . Özellikle ilgi çekici olan, gıda ve tekstil işleme endüstride kullanılan mantar sellülazlar 3-8, .
Mutant sellülazlar bir kütüphane arasında aktif varyantları belirlenmesi mühendislik süreci için kritik; aktif mutantlar, daha gelişmiş özellikler ve / için test veya ek mutagenez maruz olabilir. Etkin mühendislik mantar sellülazlar yerli organizmalar için genetik araçları eksikliği ve enzimler heterolog hosts ifade zorluklar engel olmuştur. Son zamanlarda, Morikawa ve arkadaşları E. ifade etmek için bir yöntem geliştirdi coli H. jecorina 3,9, büyük miktarlarda sellülazlar salgılaması için kapasitesi ile önemli bir sanayi mantar endoglucanases katalitik etki. Fonksiyonel E. coli ifade Macrophomina phaseolina 10 ve Phanerochaete chrysosporium 11-12 dahil olmak üzere diğer mantar, sellülazlar için de rapor edilmiştir.
Biz E. mantar endoglucanase aktivitesi yüksek kapasiteli tarama için bir yöntem mevcut coli. (Şekil 1) Bu yöntem katı ortamda büyüyen hücreleri tarafından karboksimetil selüloz (CMC) enzimatik bozulma görselleştirmek için ortak bir mikrobiyal boya Kongo Red (CR) kullanır . Aktivite assay ucuz reaktifler, minimal manipülasyon gerektirir ve koloni yerinde bozulması bölgeleri ("haleler") olarak net sonuçlar verir. Enzimatik aktivite nicel bir ölçüsüdür bu yöntemle tespit edilemez olsa da, biz hale boyutu hücredeki toplam enzimatik aktivite ile ilişkili olduğunu buldular. Ayrıca bireysel pozitif klonların karakterizasyonu, bağıl protein spor belirleyecektir.
Geleneksel tüm bakteri hücre CMC / CR faaliyet deneyleri 13, koloniler, çapraz kontaminasyon, ya da büyük ölçekli deneyler daha az yatkın olan CMC agar kuyu, kuluçka kültürleri konu üzerine agar içeren CMC dökme içerir. Burada selülaz aktivitesi için 14 mevcut yıkama yöntemleri değiştiren gelişmiş bir protokol raporu: CMC agar plakaları yetiştirilen hücreler CR boyama önce kaldırılır. Bizim protokol çapraz bulaşmayı önemli ölçüde azaltır ve binlerce klon hızlı bir tarama sağlayan, son derece ölçeklenebilir. H. yanı sıra jecorina enzimler, biz dile getirdiler ve bu protokol organizmaların bir dizi enzimler için geçerli olduğunu düşündüren, Thermoascus aurantiacus ve Penicillium decumbens (Şekil 2'de gösterildiği gibi) endoglucanase varyantları gösterildi.
Burada açıklanan protokol minimal manipülasyon, aktif enzimler hızlı ve yüksek verimlilik kimlik sağlar. Hareketi algılama oldukça duyarlıdır ve niteliksel olarak hücre içinde aktivite miktarını yansıtır. Kullanım kolaylığı, sadece E. fonksiyonel ifadesi ile sınırlı, geniş bir enzim kütüphaneler için bu yöntemi uygun hale getirir coli. Ayrıca, bu tür aktivite tarama mantar sellülazlar sınırlı değildir, ancak herhangi bir endoglucanase faaliyet için adapte edilebilir…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Gordon ve Betty Moore Vakfı tarafından ve UNCF / Merck Bilim Girişimi tarafından finanse edildi.
Reagent | Company | Product number |
---|---|---|
IPTG | Sigma | I1284 |
Congo Red | Sigma | C6277 |
Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
NaCl | Sigma | S1679 |
Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |