Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em
Summary
Vi beskriver en låg kostnad, hög genomströmning metod för att screena för svamp endoglucanase aktivitet i<em> E. coli.</em> Metoden bygger på en enkel visuell avläsning av substrat nedbrytning, inte kräver enzymet rening, och är mycket skalbart. Detta möjliggör en snabb screening av stora bibliotek av enzym varianter.
Abstract
Cellulas enzymer (endoglucanases, cellobiohydrolases och β-glucosidases) hydrolysera cellulosa till komponent socker, vilket i sin tur kan omvandlas till drivmedel alkoholer 1. Potentialen för enzymatisk hydrolys av cellulosa biomassa för att ge förnybar energi har intensifierat arbetet med att ingenjör cellulaser för ekonomisk bränsleproduktion 2. Av särskilt intresse är svamp cellulaser 3-8, som redan används industriellt för livsmedel och textilier bearbetning.
Identifiera aktiva varianter bland ett bibliotek av mutant cellulaser är kritisk till den tekniska processen, aktiva mutanter kan testas ytterligare för förbättrade egenskaper och / eller utsatts för ytterligare mutagenes. Effektiv konstruktion av svamp cellulaser har försvårats av bristen på genetisk verktyg för infödda organismer och av svårigheter att uttrycka enzymer i heterologa värdar. Nyligen utvecklade Morikawa och medarbetare en metod för att uttrycka i E. coli den katalytiska domäner endoglucanases från H. jecorina 3,9, en viktig industriell svamp med kapacitet att utsöndra cellulaser i stora mängder. Funktionell E. coli uttryck har också rapporterats för cellulaser från andra svampar, inklusive Macrophomina phaseolina 10 och Phanerochaete chrysosporium 11-12.
Vi presenterar en metod för hög throughput screening av svamp endoglucanase aktivitet i E. coli. (Fig 1) Den här metoden använder den gemensamma mikrobiella färgen Congo Red (CR) för att visualisera enzymatisk nedbrytning av karboximetylcellulosa (CMC) av celler som växer på fast substrat. Verksamheten analysen kräver billig reagenser, minimal manipulation, och ger entydiga resultat som zoner av nedbrytning ("glorior") på kolonin platsen. Även ett kvantitativt mått på enzymatiska aktiviteten inte kan fastställas genom denna metod, har vi funnit att halo storlek korrelerar med total enzymatisk aktivitet i cellen. Ytterligare karakterisering av enskilda positiva kloner kommer att avgöra, relativ protein fitness.
Traditionella bakteriell helcells CMC / CR aktivitet analyser 13 innebär att hälla agar innehåller CMC på kolonier, som är föremål för korskontaminering eller inkubera kulturer i CMC agar brunnar, vilket är mindre mottaglig för storskaliga experiment. Här rapporterar vi ett förbättrat protokoll som ändrar befintliga tvätta metoder 14 för cellulas aktivitet: celler odlas på CMC agarplattor tas bort före CR färgning. Vår protokoll minskar betydligt korskontaminering och är mycket skalbar, vilket gör att snabb screening av tusentals kloner. Förutom H. jecorina enzymer har vi uttryckt och avskärmade endoglucanase varianter från Thermoascus aurantiacus och Penicillium decumbens (visas i figur 2), vilket tyder på att detta protokoll tillämpas på enzymer från en rad olika organismer.
Protocol
Discussion
Protokollet beskrivs här möjliggör snabb och hög kapacitet identifiering av aktiva enzymer, med minimal manipulation. Aktivitet upptäckt är ganska känsliga, och kvalitativt avspeglar mängden aktivitet i cellen. Dess användarvänlighet gör denna metod lämplig för ett brett spektrum av enzym bibliotek, endast begränsas av funktionella uttryck i E. coli. Dessutom är aktiviteten screening av detta slag inte begränsat till svamp cellulaser, men kan anpassas för alla endoglucanase aktivitet, eller nå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av Gordon och Betty Moore Foundation, och av UNCF / Merck Science Initiative.
Materials
| Reagent | Company | Product number |
|---|---|---|
| IPTG | Sigma | I1284 |
| Congo Red | Sigma | C6277 |
| Carboxymethyl Cellulose | Sigma | 360384 |
| NaCl | Sigma | S1679 |
| Bacto-agar | BD Biosciences | 214030 |
| Bioassay plates | Thermo Scientific | 240845 |
References
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, . Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
