Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Summary

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Abstract

Nonostante i progressi nella modellazione tossicità dei farmaci umani, molti composti non durante gli studi clinici per effetti collaterali imprevisti. Il costo degli studi clinici sono notevoli, quindi è essenziale che più schermi tossicologia predittiva sono sviluppati e distribuiti nelle prime fasi di sviluppo dei farmaci (Greenhough et al 2010). Epatociti umani rappresentano il modello attuale gold standard per valutare la tossicità della droga, ma sono una risorsa limitata che presentano la funzione variabile. Pertanto, l'uso di linee cellulari immortalizzate e modelli tessuti animali sono normalmente impiegati per la loro abbondanza. Mentre entrambe le fonti sono informativi, essi sono limitati dalla scarsa funzionalità, la variabilità delle specie e / o instabilità nella cultura (Dalgetty et al 2009). Le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono una fonte interessante alternativa di epatociti umani come cellule (HLCS) (Medine et al 2010). PSC sono in grado di rinnovamento del sé e la differenziazione di tutti i tipi di cellule somatiche trovato negli adulti e, quindi, rappresentanouna fonte potenzialmente inesauribile di cellule differenziate. Abbiamo sviluppato una procedura che è semplice, altamente efficiente, suscettibili di automazione e rese funzionali HLCS umano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Crediamo che la nostra tecnologia porterà alla produzione scalabile di HLCS per la scoperta, la modellazione della malattia, la costruzione di dispositivi di extra-corporea e, eventualmente, le terapie cellulari a base di trapianto.

Protocol

1. Preparazione iniziale di tutti gli stock chimica e rivestimento della cultura Plasticware Tutti i passaggi da effettuare in una cappa di coltura dei tessuti in condizioni asettiche. Preparazione delle risorse umane fattore di crescita fibroblastico (hbFGF) Preparare soluzione al 10% BSA in PBS e filtrare su un filtro di 0,22 micron. Dalla soluzione al 10% di BSA preparare una soluzione 0,2% BSA. Aggiungere 10 ml 0,2% di BSA hbFGF mcg solution/100. </li…

Discussion

Abbiamo sviluppato un modello semplice, omogeneo e altamente riproducibili in vitro per generare livelli scalabili di HLCS umano. Il nostro modello è stato convalidato da una serie di laboratori esterni collaborazione. Noi abitualmente caratterizzano HLCS cellule staminali derivate usando il nostro strumento di casa nella casella dei marcatori dello sviluppo e del fegato analisi specifiche funzionali (la maggior parte dei quali sono disponibili in commercio). Le fasi critiche del nostro processo sono: il mante…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Type	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)