Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Summary

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Abstract

Apesar dos progressos na modelagem de toxicidade dos medicamentos humanos, muitos compostos falhar durante os ensaios clínicos devido a efeitos colaterais imprevisíveis. O custo de estudos clínicos são substanciais, por isso, é essencial que mais telas de toxicologia preditiva são desenvolvidos e implantados no início do desenvolvimento de drogas (Greenhough et al 2010). Hepatócitos humanos representam o modelo atual do ouro padrão para avaliar a toxicidade dos medicamentos, mas são um recurso limitado que exibem função variável. Portanto, o uso de linhagens de células imortalizadas e modelos de tecido animal são rotineiramente empregados devido à sua abundância. Enquanto ambas as fontes são informativos, eles são limitados pela função pobres, a variabilidade das espécies e / ou instabilidade na cultura (Dalgetty et al 2009). Células-tronco pluripotentes (PSC) são uma importante fonte alternativa de hepatócitos humanos como células (HLCS) (Medine et al 2010). PSCs são capazes de auto-renovação e diferenciação de todos os tipos de células somáticas encontrada no adulto e, portanto, representamuma fonte potencialmente inesgotável de células diferenciadas. Temos desenvolvido um procedimento que é simples, altamente eficiente, passível de automação e rendimento funcional HLCS humano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Acreditamos que nossa tecnologia irá levar à produção escalonável de HLCS para descoberta de drogas, modelagem de doença, a construção de extra-corpórea dispositivos e, possivelmente, terapias celulares transplante base.

Protocol

1. Preparação inicial de todas as ações químicas e revestimento da cultura plasticware Todos os passos a serem realizadas em uma capa de cultura de tecidos sob condições assépticas. Preparação de fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (hbFGF) Prepare solução de 10% BSA em PBS e filtrar através de um filtro de 0,22 mM. A partir da solução BSA 10% preparar uma solução de 0,2% BSA. Adicionar 10 mL de 0,2% BSA hbFGF mg solution/…

Discussion

Nós desenvolvemos um modelo simples, homogêneo e altamente reprodutível in vitro para gerar níveis escalável de HLCS humana. Nosso modelo foi validado por uma série de laboratórios colaboradores externos. Rotineiramente caracterizar HLCS com células-tronco derivadas usando a nossa caixa de ferramentas na casa de marcadores específicos de desenvolvimento e testes funcionais do fígado (a maioria dos quais estão disponíveis comercialmente). As fases críticas em nosso processo são: a manutenção da p…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Type	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)