הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Summary

מאמר זה יתמקד דור האנדודרם הכבד האנושי אנושי אוכלוסיות תאים גזע עובריים.

Abstract

למרות ההתקדמות רעילות התרופה דוגמנות אדם, תרכובות רבים נכשלים במהלך הניסויים הקליניים, בשל תופעות לוואי צפויות. העלות של מחקרים קליניים הם משמעותיים, ולכן חיוני יותר מסכי הרעלים חזוי מפותחים לפרוס בשלב מוקדם של פיתוח התרופה (Greenhough et al 2010). Hepatocytes האדם מייצגים את המודל הנוכחי זהב סטנדרטי להערכת רעילות התרופה, אבל הם משאב מוגבל כי התערוכה פונקציה משתנה. לכן, השימוש של שורות תאים ורקמות הנציח במודלים של בעלי חיים מועסקים באופן קבוע בשל השפע שלהם. בעוד שני מקורות מידע, הם מוגבלים על ידי פונקציה עניים, השתנות המינים ו / או חוסר יציבות של תרבות (Dalgetty et al 2009). בתאי גזע pluripotent (PSCs) הם מקור חלופה אטרקטיבית של hepatocyte אדם כמו תאים (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs מסוגלים התחדשות עצמית והבחנה לכל סוגי תאים סומטיים נמצא המבוגר ובכך מייצגיםמקור פוטנציאלי בלתי נדלה של תאים מובחנים. פיתחנו הליך פשוט, יעיל ביותר, מקובל אוטומציה התשואות HLCs אדם תפקודית (Hay et al 2008; פלטשר et al 2008; חנון et al 2010; פיין et al 2011 ו Hay et al 2011). אנו מאמינים כי הטכנולוגיה שלנו יוביל לייצור להרחבה של HLCs עבור גילוי תרופות, מחלות דוגמנות, בניית חוץ הגשמי מכשירים סלולריים ואולי טיפולים להשתלה מבוסס.

Protocol

1. הכנה ראשונית של כל מניות הכימיה ציפוי של תרבות plasticware כל השלבים להתבצע במנדף בתרבית רקמה בתנאים aseptic. הכנה של האדם גורם גדילה בסיסי פיברובלסטים (hbFGF) <li style=";t…

Discussion

פיתחנו מודל פשוט, הומוגנית לשעתקו מאוד במבחנה כדי לייצר רמות להרחבה של HLCs האדם. המודל שלנו קיבל תוקף על ידי מספר מעבדות פעולה חיצוניים. אנו שגרתי לאפיין בתאי גזע שמקורם HLCs באמצעות ארגז הכלים שלנו לבית של סמנים התפתחותי מסוים מבחני תפקודי כבד (שרובם זמינים מסחרית)…

Materials

Matrigel coating plates and flasks

1. Matrigel (10 mL, BD Biosciences, UK); store at -20°C.
2. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
3. Tissue culture plates (6 well, 12 well, Corning, UK)
4. Tissue culture flask (25 cm2 vented, Corning, UK)

hESC Maintenance

1. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA); store at -20°C.
2. BSA solution (50 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
3. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.

Passaging hESCs with collagenase

1. Confluent well or flask of hESCs.
2. Matrigel coated wells or flasks as appropriate.
3. Phospate buffered saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
4. Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
5. Mouse embryonic fibroblast conditioned medium (MEF-CM) (100 mL, R & D Systems, USA).
6. Human basic fibroblast growth factor (100 μg, Peprotech, USA).

Differentiation of hESCs to hepatic endoderm

1. RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
2. B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
3. Activin A (2 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
4. Recombinant mouse Wnt3a (2 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
5. KO-DMEM (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
6. KO-SR (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
7. Non-essential amino acids (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
8. β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at 4°C.
9. DMSO (Sigma Aldrich, UK); store at room temperature
10. Leibovitz L-15 culture medium (500 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
11. Tryptose phosphate broth (100 mL, Sigma Aldrich, UK); store at 4°C.
12. Foetal bovine serum, heat inactivated (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
13. Hydrocortisone 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
14. Insulin (bovine pancreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
15. L-Glutamine (100 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at -20°C.
16. Ascorbic acid (25 g, Sigma Aldrich, UK); store at -20°C.
17. Human HGF (10 μg, Peprotech, USA); store at -20°C.
18. Recombinant Human Oncostatin M (OSM) (50 μg, R & D Systems, USA); store at -20°C.
19. Syringe driven filter unit 0.22 μm (Millipore, UK)

Characterisation of hESC derived Hepatic Endoderm

Immunostaining

1. Phosphate buffer saline (-MgCl₂, -CaCl₂) (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); store at room temperature.
2. PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 (Sigma-Aldrich, UK).
3. Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) is made up in PBS, store -20°C.
4. Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
5. Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), store at room temperature.
6. Ethanol
7. Serum (AbD Serotech, UK), store at -20°C.
8. Secondary Antibody, Alexa Fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, UK).
9. MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) is made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) is added to the MOWIOL solution at a 1:1000 dilution.

Primary antibodies
Antigen*	Type	Supplier	Dilution
ALB	Mouse Monoclonal	Sigma Aldrich	1/500
E-Cadherin	Mouse Monoclonal	Millipore	1/100
α-fetoprotein	Mouse Monoclonal	Sigma	1/500
SSEA-4 FITC	Mouse Monoclonal	Biolegend	1/100
IgG	Mouse Monoclonal	DAKO	1/500
Secondary antibodies
Anti-mouse FITC conjugate	Goat Monoclonal	Invitrogen	1/400

Table 2. The antibodies used for hESC derived hepatic endoderm immunostaining, the concentrations used, the species developed in and the companies they are purchased from.

Functional Analysis of Hepatic Endoderm and Normalisation (per mg protein)

Cytochrome P450 Assays

1. p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits and luminometer (Promega, USA).
1. White flat bottom 96 well assay plate (BD Biosciences, UK).
2. BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK).
3. Transparent 96 well assay plate (IWAKI, UK)